книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

эффективности колонки, увеличивая концентрацию неподвижной фазы до 1,5%. Небольшая потеря в эффективности колонки ком­ пенсируется при этом повышением отношения распределения об­ разца, увеличением емкости образца и повышением стабильности колонки. Оптимальный уровень концентрации неподвижной фазы для определенного носителя во многом зависит от таких факторов, как вязкость неподвижной фазы, молекулярный вес и тип жидкости

1,4

1,2

>

£0,6

0,4

0,2

°0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

Неподвижная фаза, вес. °/в

(полярность и т. д.). Рекомендуется использовать такие наивыс­ шие концентрации неподвижной фазы, которые не приводят к рез­ кому уменьшению эффективности колонки. Предлагаемые концен­ трации неподвижных фаз для некоторых носителей, используемых в ЖЖХ, даны в табл. 5.2.

1,1%. С корасилом I довольно просто получить воспроизводимую насадку: колонку заполняют сухим носителем и пропускают через нее в течение ночи подвижную фазу, насыщенную неподвиж­ ной [14].

4. Внутренний диаметр колонки

Хотя эффективность колонки зависит от размера частиц носи­ теля и длины самой колонки [15], на высоту тарелки значительное влияние оказывает также внутренний диаметр колонки. Опыт ра­ боты показывает, что оптимальный внутренний диаметр колонки 2—3 мм; используя колонки такого диаметра, можно найти опти­ мальное соотношение между емкостью по образцу, количеством используемой насадки, необходимым количеством растворителя и эффективностью колонки. При упаковке колонок с внутренним диаметром меньше 2 мм сухим методом эффективность их пони­ жается [12]. Авторы работ [16, 17] сообщают о высокой эффектив­ ности колонок с внутренним диаметром 10—11 мм. Аномальная форма пиков, зависящая от длины колонки, наблюдалась в ко­ лонках с внутренним диаметром 5—7 мм. Это искажение может, вероятно, вызываться тем, что молекулы образца, достигая стенок, где линейная скорость подвижной фазы выше средней, движутся по колонке быстрее, чем молекулы, находящиеся в центре колонки, где скорость подвижной фазы меньше средней. В очень узких ко­ лонках перенос вещества от стенки к стенке значительный, так что пик вещества, вымываемого из колонки, обычно симметричен. Послеколоночное выравнивание пика вещества не проявляется, если внутренний диаметр колонки таков, что молекулы растворенного вещества достигают стенки колонки, но покидают колонку прежде, чем возвращаются в центр. При этом зона вымывается несиммет­ рично, иногда с искажением хвостов хроматограммы или, что слу­ чается реже, двойными пиками. Очевидно, наивысшая эффектив­ ность колонки наблюдается в том случае, когда молекулы растворенного вещества не достигают стенок колонки — условие, называемое в колоночных явлениях «бесконечный диаметр». Внут­ ренний диаметр колонки «бесконечного диаметра» можно опреде­ лить из уравнения

rfc = (2,4rfp L)-2 .

.Например, чтобы быть колонкой «бесконечного диаметра», колон­ ка длиной 0,5 м (L), заполненная частицами диаметром 30 мкм (dp), должна иметь минимальный внутренний диаметр 6 мм (dc).

При работе с жидко-жидкостными хроматографическими ко­ лонками желательно вводить внутрь колонки растворы образцов, приготовленных в растворителе, точно соответствующем составу

Жидко-жидкостная хроматография 133

подвижной фазы. Если растворы образца приготовлены в раство­ рителе, который обладает большей растворимостью по отношению к используемой неподвижной фазе, небольшие количества послед­ ней растворяются растворителем образца аликвотно с каждым введением. Растворимость неподвижной фазы можно уменьшить, предварительно насыщая используемый для приготовления образ­ ца растворитель неподвижной фазой; в противном случае непод­ вижную фазу можно снять с носителя. Если колонка содержит насадку с химически связанной фазой (см. разд. Ж данной главы), никаких особых мер предосторожности предпринимать не надо, и образец обычно можно приготовить в любом подходящем для си­ стемы растворителе. Полярные растворители не вызывают изме­ нений в колонках с химически связанной фазой, но могут давать большие начальные пики на хроматограмме, в частности, при ис­ пользовании детекторов, зависящих от общих свойств раствора.

Образец, растворенный в полярном растворителе и содержа­ щий плохо растворимые компоненты, нельзя вводить в неполярную подвижную фазу, так как он может выпасть в осадок в потоке подвижной фазы. Это приведет к катастрофическому уширению пиков и появлению хвостов.

На эффективность колонки большое влияние оказывает объем и способ ввода образца в колонку. Наивысшая эффективность ко­ лонки иногда достигается вводом образца прямо вверх в центр насадки колонки. В этом случае диффузия пика образца до по­ ступления его в колонку сводится до минимума. Ввод образца в поток растворителя перед насадкой колонки приводит к тому, что образец поступает в колонку в виде размытого пика и эффектив­ ность колонки понижается для тех компонентов образца, которые быстро вымываются. Для эффективного ввода образца можно так­ же использовать тщательно сконструированные микрокраны, как это описано в гл. 2. Метод ввода образца оказывает большое влия­ ние на симметрию пика, что очень важно для получения макси­

объем образца для колонок определенного внутреннего диаметра. Рис. 5.6 показывает влияние объема пробы (постоянный вес образ­ ца) на высоту тарелки в Ж Ж Х для колонки размером 1 м X 2,1 мм (внутренний диаметр) с поверхностно-пористым носителем с кон­ тролируемой поверхностью. Эти данные указывают, что в данную колонку, не изменяя существенно ее эффективность, можно вво­ дить пробы объемом вплоть до 50 мкл. Большие объемы пробы допустимы при условии, что образец имеет большие значения kf. Влияние объема пробы на эффективность колонок, изготовленных из того же материала, но имеющих другие внутренние диаметры, обычно является линейной функцией площади поперечного сечения колонки и зависит от носителя, загрузки неподвижной фазой.

Метод испарения растворителя. В ЖХ для нанесения на носи­ тель жидкой неподвижной фазы применяется метод испарения растворителя, широко используемый в ГХ. Материал для заполне­ ния колонок приготовляется путем суспендирования носителя в растворе неподвижной фазы в летучем растворителе, например дихлорметане. Летучий растворитель удаляется испарением, в то время как смесь осторожно перемешивается током сухого воздуха или азота до тех пор, пока полностью не высохнет. С хрупкими ди­ атомитами эту операцию следует проводить особенно аккуратно. Осколки частиц, разрушающихся при перемешивании, образуют «пыль», которая снижает проницаемость и разрешение колонки.

Поверхностно-пористые носители, механически гораздо более прочные, могут обрабатываться с меньшими предосторожностями. Эти материалы могут быть покрыты методом осаждения непод­ вижной фазы из летучего растворителя при испарении его в токе сухого азота или воздуха при медленном вращении в круглодонной колбе. О воспроизводимости, с которой неподвижные фазы могут быть нанесены на поверхностно-пористый носитель с контро­ лируемой пористостью, говорилось в предыдущем разделе.

Метод фильтрации растворителя. Материал для заполнения ко­ лонок может быть также приготовлен методом фильтрации раство­ рителя, популярным у некоторых хроматографистов. По этой мето­ дике избыточное количество 5—10%-ного раствора неподвижной фазы в летучем растворителе наливается на носитель, находя­ щийся в колбе. Чтобы удалить воздух из носителя, раствор не­ сколько раз вакуумируется; обезгаженный раствор гарантирует полноту смачивания носителя раствором. Избыток раствора от­ фильтровывается, и носитель высушивается при осторожном пере­ мешивании в токе азота или воздуха или при мягком нагреве. Хотя, используя этот метод, можно получить насадку удов­ летворительного качества, определить с достаточной точностью истинное количество неподвижной фазы, нанесенной на носитель, не представляется возможным. Кроме того, пока эта процедура не будет проводиться с необходимой тщательностью, трудно получить насадку с воспроизводимым количеством неподвижной фазы.

фазы в летучем растворителе. Раствор удаляется из пустот слоя насадки с помощью медленного противотока сухого воздуха или азота. Оставшийся растворитель затем испаряется этим же пото­ ком газа. Используя растворы, содержащие различные концентра­ ции неподвижной фазы, можно изменять загрузку колонки. Нане­ сенная этим способом неподвижная фаза распределяется по

часа. Это позволит установить, упакована ли колонка с макси­ мальной плотностью. Если плотность упаковки ниже максимально возможной, то из-за усадки насадки на входе в колонку будет по­ являться свободный объем. Если такое наблюдается, то это озна­ чает, что колонка приготовлена нетщательно и должна быть пере­ делана.

После завершения процесса упаковки, чтобы удержать насадку, у ввода в колонку можно поместить небольшую пробку из кварце­ вой ваты. Если проба подается в поток, а не непосредственно в колонку, на вводе в колонку можно поместить фильтр из металло­ керамики или тефлона.

Описанная выше методика представляет собой только один из способов сухой упаковки колонки в ЖХ. Для упаковки колонки пригоден любой способ, обеспечивающий быстрое достижение плотной стабильной структуры. Например, во время заполнения колонки поверхностно-травлеными стеклянными насадками реко­ мендуется уплотнять их стеклянной палочкой [19].

Следует заметить, что вибрация хроматографических колонок в процессе сухой упаковки колонок обычно нежелательна. В то же время в ГХ такая методика часто используется для заполнения колонок [19]. Когда по описанной выше методике заполняется ко­ лонка большого внутреннего диаметра, колонку желательно вра­ щать в течение всего процесса заполнения.

типа носителя и размера его частиц. Для упаковки частиц мень­ шего диаметра обычно нужно больше времени.

Описанным выше методом можно приготовить высоковоспроизводимые колонки с таким носителем, как зипакс и другими по­ верхностно-пористыми носителями. Четыре колонки, заполненные носителем с контролируемой поверхностной пористостью одной партии, показали при двух очень сильно отличающихся линейных скоростях подвижной фазы воспроизводимость в среднем 2—5% (относительных) и по времени удерживания и по высоте тарелки [12]. Эта методика сухого заполнения колонок дает также удовле­ творительные результаты для пористых несферических насадок, таких, как диатомиты, пока размер частиц более 50 мкм.

Суспензионный метод заполнения. Некоторые насадки, которых имеют очень маленький размер, заполняются в колонку суспензионным или мокрым способом. При этом в результате не­ одинаковой скорости оседания или в результате возникновения конвекционных токов может наблюдаться разделение частиц по размерам и по плотности. Эту проблему можно решить, используя для формирования насадки фильтрационные процессы (а не седиментационные). В фильтрационном способе суспензия посту­ пает в колонку с высокой скоростью под большим давлением.

В результате здесь нет возможностей для седиментации или для

138 Глава 5

возникновения нежелательных конвективных токов, нарушающих поток частиц, как в седиментации. Однако с обычными насадками в ЖЖХ суспензионный способ заполнения не практикуется, так

лансированную суспензию затем быстро прокачивают через хроматографическую колонку при давлении, значительно превы­ шающем то, при котором эта колонка будет использоваться [20]. Условия заполнения колонки любым материалом насадки зависят от плотности и размера частиц и других свойств самого материала. Таким способом можно успешно приготовить колонки с хромато­ графической насадкой типа пермафаза. Тем не менее условия для суспензионного способа заполнения колонок изучены недостаточно, чтобы оптимизировать методику. Результаты иногда отличаются по причинам, которые не были установлены.

Различные иногда используемые варианты мокрого заполнения включают скрепление плохо упакующихся структур со связующим, таким же, как используемый в тонкослойной хроматографии; про­ цесс скрепления предусматривает использование в качестве суспензионной жидкости воду [18]. Этот метод, который также яв­ ляется суспензионным процессом, заключается в следующем. Со­ суд заполняют перемешиваемой под давлением смесью упакую­ щего материала и активированной суспензии гипса в дистилли­ рованной воде при температуре около 75 °С. Суспензия затем поддавливается азотом и поддерживается гомогенной за счет бы­ строго перемешивания. Краны, установленные на линии в нижней части колонки, открываются, суспензия поступает в колонку (ко­ лонка всегда должна быть заполнена дистиллированной водой) и начинается заполнение колонки. Когда колонка заполнится, краны закрывают и оставляют колонку на час, чтобы процесс скрепле­ ния закончился. Неподвижную фазу можно затем нанести на но­ ситель методом, предложенным для предварительно упакованных колонок в предыдущем разделе.

Д. Влияние подвижной фазы

/.Обезгаживание подвижной фазы

Подвижную фазу желательно обезгаживать перед прокачива­ нием через хроматографическую колонку. Воздух, растворенный в подвижной фазе при высоких давлениях, может образовывать небольшие пузырьки в элюате, а это нарушает нормальную работу многих детекторов, в частности тех, в которых используются опти­ ческие свойства. Как правило, растворимость воздуха выше в бо-

Жидко-жидкостная хроматография 139

лее полярном растворителе. Удалить растворенный воздух проще всего вакуумированием (~50 мм рт. ст. или меньше) контейнера с перемешиваемой подвижной фазой, вакууми-рование проводите вплоть до видимого выделения пузырьков. Чтобы ускорить про­ цесс обезгаживания, контейнер можно нагреть. При этих условиях водные растворы, в которых растворимость кислорода относитель­ но высока, могут быть обезгажены за 5 мин.

Обезгаживание подвижной фазы необходимо также и потому, что растворенный кислород может реагировать с подвижной или

фазы инертным газом, например азотом. В действительности кис­ лород является главной причиной образования пузырьков газа в детекторе. Насыщение подвижной фазы инертным газом жела­ тельно, даже если образование газовых пузырьков в детекторе не мешает определению.

Чтобы избежать образования маленьких газовых пузырьков в ультрафиолетовом или рефрактометрическом детекторе, необхо­ димо увеличить давление внутри кюветы до 0,35—1,4 атм.; с этой целью частично перекрывают кран, установленный на выходе из детектора.

2. Равновесие подвижной и неподвижной фаз

Поскольку в процессе жидко-жидкостного хроматографирования какие-то несмешивающиеся жидкости до некоторой степени растворяются друг в друге, то для продления жизни хроматогра­ фической колонки необходимы специальные меры. Подвижную фазу необходимо предварительно насыщать неподвижной, чтобы избежать удаления последней из колонки в процессе хроматографирования. Полное равновесие двух несмешивающихся жидкостей в действительности достигается труднее, чем это можно предпо­ ложить. Ввиду ограниченной растворимости двух фаз контакт между ними при смешивании относительно плохой. Описанный ниже метод, как было установлено, позволяет достичь состояния удовлетворительного равновесия двух фаз. Заключается он в сле­ дующем. Обе фазы (обезгаженные или насыщенные азотом) поме­ щаются под азотом в закрытый контейнер в отношении от 10/1 до 50/1 (подвижная/неподвижная), быстро смешиваются магнитной мешалкой до образования мутной воронки и перемешиваются не­ сколько часов или ночь. После этого фазы разделяются; подвиж­ ная фаза используется для хроматографирования, а неподвиж­ ная — возвращается в цикл.

Чтобы достичь полного равновесия между подвижной и непод­ вижной фазами в хроматографической колонке, желательно ис­ пользовать «предварительную» колонку. Такая «предварительная» колонка, установленная в проточной системе сразу перед вводом