книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

ная хроматография в трубках (капиллярные колонки) при лами­ нарном потоке приводит к очень большим уширениям пика. Чтобы ускорить массоперенос в подвижной фазе, необходимо применять частицы малого размера (dp ^ 80 мкм), что приводит к увеличе­ нию сопротивления потоку в упакованных колонках. Кроме того, как уже отмечалось некоторыми авторами данной книги (см. так­ же [4]), заполнять колонки частицами с dp ^ 25 мкм достаточно трудно и воспроизводимость упаковки при этом плохая.

2. Вязкость

Из-за высокой вязкости и маленького размера частиц высоко­ скоростная жидкостная хроматография требует перепада давления в колонках порядка 10—100 атм. Выпускаются насосы, обеспечи­ вающие давление свыше 500 атм, но при таком высоком давлении вся конструкция прибора становится слишком громоздкой. Кроме того, объемная скорость потока для насосов, работающих при по­

в колонку является верхним пределом, и, как следствие, лимити­ руется длина используемой колонки. Согласно опубликованным данным, в большинстве случаев число эффективных тарелок в ко­ лонках высокоскоростной ЖХ не достигает 1000, а обычно даже меньше 500.

3. Взаимодействия между элюентом и неподвижной фазой

Образец и элюент должны быть химически «подобны», так как образец должен растворяться в элюенте. В то же время распре­ деление образца между подвижной и неподвижной фазами воз­ можно только в том случае, когда образец и неподвижная фаза «подобны». Следовательно, жидкие неподвижные фазы обычно в какой-то степени растворимы в подвижной фазе, и колонка «кро­ воточит», если элюент предварительно не насыщен неподвижной фазой. Однако провести точное предварительное насыщение очень сложно, а увеличение или уменьшение количества неподвижной фазы из-за отсутствия равновесия приводит к изменению времени удерживания. Эти эффекты становятся наиболее важными при низких концентрациях неподвижных фаз в колонке. С этой точки зрения предпочтительнее использовать активные твердые или хи­ мически связанные неподвижные фазы.

4. Ввод образца

При высоком давлении на входе в колонку образец можно вво­ дить тремя способами: 1) прерывая поток элюента [5], 2) с по­ мощью поворотного крана [6] и 3) с помощью шприца, непосред­ ственно в поток, находящийся под высоким давлением [7].

Экспериментально первый метод самый простой. Однако после ввода образца скорость потока восстанавливается только спустя какое-то время, поэтому точно измерить время удерживания не­ возможно. Кроме того, при таком способе ввода образца уси­ ливается механическая деструкция материала, заполняющего колонку.

С помощью поворотного крана в систему можно вводить об­ разцы объемом не менее 3 мкл. Шприц, с помощью которого вводят образец в поток высокого давления, должен иметь соответ­ ствующие уплотнения, иначе возможен эффект «фонтанирования». Эффект «фонтанирования» проявляется в тот момент, когда игла шприца вынимается наружу: резиновая прокладка не успевает за­ тянуться, и под действием высокого давления жидкость вытекает. Эту проблему можно решить, используя соответствующие приспо­ собления для ввода образца [7]. Имеется один тип шприца («Hamilton Company, Whlttier, Calif.», шприц высокого давления,

службы прокладки определяется ее стойкостью к подвижной фазе.

При ламинарном потоке вследствие малых коэффициентов

и с уменьшением внутреннего диаметра колонки увеличиваются. Например, можно наблюдать ложный максимум на кривой зави­ симости высоты тарелки от линейной скорости подвижной фазы вместо линейно восходящей ветви, получаемой при измерении на надлежащем оборудовании [9]. С соединительными трубками вну­ треннего диаметра всего лишь 0,25 мм и длиной 20 см относитель­ ное уширение пиков может возрастать в 10 раз. С другой стороны, прибор ложно отражает разрешение намного лучше дей­ ствительного [12]. Кроме того, аппаратура, часто используемая в стандартной высокоскоростной жидкостной хроматографии, изме­ ряет все, что угодно, только не действительное разрешение внутри колонки [12].

Как показывают расчеты и эксперименты [12], в действитель­ ности измеряемое разрешение Rs не зависит от объема трубок и детектора, если сам поток не вызывает уширения в трубках и де­ текторе. Нарушение характера ламинарного течения в результате

изменения геометрии трубки может вызывать резкое уменьшение уширения пика, особенно при высоких линейных скоростях элюента [9, 11].

зать, инертен образец или нет. Существует четыре различных спо­

молекул самого элюента. Однако для этого необходимы специаль­ ные детекторы. Кроме того, объем детектора, используемого в обычной работе, не идентичен объему специального детектора, что приводит к изменениям времени удерживания.

2.Гомолог с числом углеродов меньшим, чем в элюенте, обыч­ но не удерживается.

3.Если скорректированное время удерживания соединения по­

стоянно в диапазоне температур 20—50 °С, то указанное соедине­ ние можно считать инертным.

4. Для регулярно упакованных колонок, где отношение вну­ треннего диаметра dc к размеру частиц dp больше 10, можно ап­ проксимировать линейную скорость элюента. Если носитель пори­ стый (например, силикагель, окись алюминия, хромосорб или по-

Если размер частиц в регулярно заполненной колонке больше 20—30 мкм, то с хорошим приближением можно принять, что

или, как следует из уравнений (9.3) и (9.4),

В газовой и жидкостной хроматографии, если размер частиц больше 80—100 мкм, на восходящей ветви кривой зависимости Я

9

от v Я ~ dp, если все другие параметры постоянны. Преобразуя уравнение (9.5) в соответствии с этим допущением, получаем

или Nefj не изменилось, колонку следует удлинить в 9 раз. Прони­ цаемость, однако, при этом также возрастет в 9 раз, и перепад давлений в удлиненной колонке не изменится.

8. Ситовые фракции

Кроме того, из опыта известно, что внутри определенной сито­ вой фракции проницаемость К0 пропорциональна наименьшему размеру частиц, а высота тарелки Я е / / — наибольшему. Следова­ тельно, чтобы получить требуемое минимальное отношение Н/К°, соотношение самого большего и самого меньшего размера частиц должно быть как можно меньше.

В. Некоторые соображения о разрешении колонки

/. Скорость анализа

Скорость анализа характеризуется числом теоретических Л/ или эффективных Neff тарелок, полученных за секунду:

тельно, чтобы скорость анализа была оптимальной, необходимо использовать частицы самого малого диаметра. Когда размер ча­

циента емкости к' образца, хотя все измерения были сделаны в

но одинаковым АР), нельзя предсказать, в которой из колонок

ных различными ситовыми фракциями носителя, следует прово­

ростной жидкостной хроматографии. Получается, что кривые для колонок с меньшими dp всегда будут свидетельствовать о невыгод­ ности колонок, если насадки (кроме dp) одинаковы.

Когда для построения графика используется зависимость при­ веденной высоты тарелки, dp в действительности не является ха­ рактеристикой ситовой фракции. Не известно, какое значение dp (меньшее, среднее или большее) ситовой фракции использовалось для расчета приведенной высоты тарелки. Если отношение разме-

ров больших частиц ситовой фракции к меньшим сравнительно не­ велико, эта проблема становится чрезвычайно сложной. Сравнение эффективности различных упаковочных материалов необходимо проводить с идентичными ситовыми фракциями. Конечно, если речь идет о разделении, сравнивается зависимость Нец (а не Н) от v. Кроме того, сравнение зависит от природы разрешаемого образца.

В литературе изредка сравниваются значения H/dP в опреде­ ленном диапазоне линейных скоростей (или, что хуже, при по­ стоянной скорости потока) элюента. Такое сравнение лишено смыс­ ла. Приведенная высота тарелки, если это возможно, должна сравниваться при одной и той же приведенной линейной скорости.

3. Оптимальные линейные скорости

Из уравнения (9.7) однозначно следует, что длительность ана­ лиза t пропорциональна Heff/v. Более быстрый анализ требует изменения АР, так как перепад давления возрастает с увеличе­ нием линейной скорости. Линейные скорости, используемые в вы­ сокоскоростной жидкостной хроматографии, всегда соответствуют восходящей ветви кривой зависимости Heff от v. Если наклон вос­ ходящей ветви уменьшается с увеличением линейной скорости, разделение будет происходить быстрее всего при максимальной линейной скорости, т. е. при максимально допустимом перепаде давления.

4.Разрешение

Если предположить, что A^eff, = A/"eff2 и ( а + 1 ) = 2а (где а — относительное удерживание), можно показать, что разрешение Rs определяется следующим выражением:

В соответствии с вторым предположением уравнение (9.7) справедливо только в том случае, когда два разрешенных пика не отстоят далеко друг от друга. Однако это равнозначно отсутствию максимального разрешения, необходимого в аналитической работе. Если разделение до базовой линии (для симметричных пиков Rs = 1,5) достигается в результате увеличения разрешения, уве­ личится длительность анализа, и никакого выигрыша в количе­ ственном анализе не будет наблюдаться.

5. Относительное удерживание

Согласно уравнению (9.7), разделение двух компонентов в ко­ лонке с плохой эффективностью Neff возможно в том случае, если а достаточно велико. До настоящего времени влияние неподвиж ных фаз на решение многих проблем разделения в обычной ра­ боте не изучалось в достаточной степени. Частично это компенси­ руется программированием параметров в процессе анализа, т. е. программированием температуры или потока или, что особенно важно, использованием градиентного элюирования.

Г. Новые колонки для жидкостной хроматографии

/. Неподвижные фазы

Как уже говорилось в гл. 6, твердые неподвижные фазы опти­ мальны, если они не растворимы в элюенте. Они должны быть прочными, чтобы противостоять высоким давлениям подвижной фазы. В качестве твердых неподвижных фаз в основном исполь­ зуются окись алюминия, силикагель и другие силикатные активные твердые вещества. Эти высокоактивные твердые вещества гигро­ скопичны, и их активность зависит от содержания в них воды. Поэтому содержание воды в твердой неподвижной и в жидкой подвижной фазах (а следовательно, и температура) должно тщательно контролироваться.

Если «жидкая» неподвижная фаза химически связана с носи­ телем, ее также следует рассматривать как твердое вещество. Преимущества свойств таких фаз описаны в гл. 5 и будут обсуж­ даться далее в этой главе. Однако часто приготовить такие непо­ движные фазы не просто.

2. Типы колонок

В жидкостной хроматографии большинство анализов прово­ дится на регулярно упакованных колонках, где dcJdp > 10. В не­ регулярно упакованных колонках отношение диаметра колонки

к размеру частиц меньше 5 [13—15]. Основное преимущество нере­ гулярно упакованных колонок над регулярно упакованными со­ стоит в том, что для определенной линейной скорости и размера частиц значения Н или #е // остаются постоянными, но проницае­ мость у нерегулярно упакованных колонок возрастает почти в 10 раз. Некоторые преимущества этих колонок в жидкостной хро­ матографии продемонстрированы в работе [16].

Большинство используемых в хроматографии носителей пори­ стые. Достоинством носителя с непроницаемым твердым ядром, окруженным тонким слоем пористого вещества (поверхностно-по­ ристые носители) является высокая скорость массопереноса в не­ подвижной фазе. Это подчеркивается в теоретических работах [16, 17] и демонстрируется на примере экспериментальных работ, проводимых в газовой [18—20] и жидкостной [21—23, 30] хромато­ графии, и, в частности, обсуждается в гл. 1.

Как следует из уравнений (9.1) и (9.2), при одних и тех же линейных скоростях v в случае поверхностно-пористого носителя объемная скорость F (при одинаковом внутреннем диаметре коло­ нок) может быть вдвое меньше. Максимально возможная для дан­ ного насоса скорость потока с увеличением давления уменьшается. Таким образом, в жидкостной хроматографии высокого давления лимитирующими величинами являются не только перепад давле­ ний, но и объемная скорость потока.

Поскольку объем неподвижной фазы в колонке с ППН меньше, чем в колонке с пористыми носителями; в первом случае исполь­ зуется меньший объем анализируемого вещества. По той же при­ чине отношение емкостей k' колонок с ППН обычно меньше. Ввиду ограниченной емкости пиков при анализе сложных смесей это является недостатком ППН. При скорости выше 1 см/с k' с уве­ личением скорости может уменьшаться, если сама неподвижная фаза — пористое активное твердое вещество [23]. Однако из-за высокой эффективности ППН этот тип заполняющего колонку ма­ териала обычно выгоднее.

Наносить на поверхностно-пористые насадки жидкие неподвиж­ ные фазы следует чрезвычайно осторожно [24]. Используемые в высокоскоростной жидкостной хроматографии поверхностно-пори­ стые насадки имеют удельную площадь поверхности носителя око­

поверхности активно. В зависимости от соотношения твердого ве­

подвижную фазу следует насыщать неподвижной. Если концентра­ ция жидкой неподвижной фазы на твердом веществе ниже равно­ весной, она будет адсорбироваться на ППН до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие. В это время значения W и а непре­ рывно меняются [24]. В то же время, если количество жидкой не­ подвижной фазы выше равновесного, относительное удерживание меняется при изменении соотношения твердого носителя и жидкой неподвижной фазы.

Неподвижные фазы типа «щетки» получают этерификацией по­ верхности стекла первичными спиртами. О преимуществах «ще­ ток» (по сравнению с пористым стеклом) как носителей в газовой и жидкостной хроматографии говорится в работе [27]. Большим недостатком этих носителей является то, что они подвержены гид­ ролизу. Следовательно, необходимо разделение проводить особо осторожно, если элюент содержит протонодонорные жидкости, как,

тель, этерифицированный полиэтиленгликолем 400. Размер образ­ ца не так уж мал: 60 мкг; элюентом служит смесь гексана и 10% изопропанола.

Это типичный хроматографический анализ при небольших зна­ чениях k' и значительном времени удерживания (измерено по вре­ мени разделения, как показано на рисунке). Хотя длительность анализа сама относительно невелика, линейная скорость элюента

должно быть минимальным). В то же время значение А/е//, опре­ деленное из хроматограммы, равно только 54, а разрешение про­ порционально V^eff- В табл. 9.1 показано, что N уменьшается с уменьшением значения k', но Neff увеличивается с увеличением отношения емкости. Хотя для соединения D эффективность равна только 141, для соединений С и D вследствие высокого от-

2

<

нента. Идентификация пиков: А — ж - ксилол (ft'=0); В — 2,6-ксили- дин (ft' =0,18); С — 2,3-ксилидин (ft'=0,29); D — анилин (ft'=0,61).

Основные характеристики разделения, представленного на рис. 9.1

разделениям. Отметим, что при v — 0,27 см/с перепад давления составляет 3,5 атм. Для решения другой задачи можно просто удлинить колонку до 10 м или, если необходимо, пропускать через более длинную колонку поток с большей скоростью, это позволит сократить длительность анализа.

взаимной растворимости.