книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

в адсорбенте. В таких случаях достаточно опять пропустить через колонку растворитель с требуемым содержанием воды. Когда удер­ живаемый объем некоторого стандартного вещества не меняется, колонка находится в равновесии с растворителем. Следует от­ метить, что равновесие адсорбента с полярными растворителями устанавливается скорее, чем с неполярными (см., например, [1]) из-за ограниченной растворимости воды в последних. В некоторых случаях, прежде чем будет достигнуто равновесие, через колонку придется пропустить несколько сот объемов колонки растворителя. Если в случае неполярного растворителя необходимо установить, является ли содержание воды равновесным, через колонку между последовательными вводами стандартного вещества пропускают 10—20 объемов колонки растворителя.

3. Влияние температуры колонки

В ТЖХ редко имеет смысл преднамеренно изменять темпера­ туру колонки. Особые эффекты разделения, вызываемые измене­ ниями температуры, обычно легко можно дублировать более про­ стым способом: изменяя содержание воды в адеорбенте или рас­ творителе. Исключение составляет препаративное разделение трудно растворимых образцов, где увеличение температуры ко­ лонки может быть единственным способом растворения достаточ­ ных количеств образца. В ТЖХ изменение температуры вызывает изменение величины k'\ значения k' уменьшаются с ростом тем­ пературы. Обычно k' уменьшается примерно на 1 % при повыше­ нии температуры на 1 °С; такие изменения редко вызывают какиелибо осложнения при применении нетермостатированных колонок. По этой причине большинство разделений методом ТЖХ прово­ дится при комнатной температуре, температура в колонке при этом не контролируется.

Г. Особые проблемы твердо-жидкостной хроматографии

В большинстве случаев применение ТЖХ для решения опреде­ ленной задачи разделения не представляет сложности и не вызы­ вает беспокойства (по крайней мере если образец пригоден для исследования указанным методом; см. разд. А данной главы). Од­ нако мы должны отметить три до некоторой степени общие про­ блемы, которые иногда приходится решать: 1) изменения или потери образца в процессе разделения; 2) трудности в воспроиз­ водстве адсорбента; 3) нестабильность работы колонки.

Изменения или потери образца в процессе разделения могут возникать из-за реакций в образце, катализируемых адсорбентом, или из-за необратимой адсорбции образца. Уже в течение 40 лет исследователи высказывают недовольство по тому поводу, что в

Твердо-жидкостная хроматография 171

процессе твердо-жидкостного хроматографирования образец всту­ пает в реакции. Широко используемые адсорбенты часто являются соединениями кислотного или основного характера, и поэтому об­ разцы, чувствительные к рН, могут претерпевать изменения на та­ ких адсорбентах. В присутствии адсорбента способность образца к окислению обычно возрастает. Решить эти проблемы можно, не применяя кислотные или основные адсорбенты, если образцы со­ ответственно чувствительны к кислотам или основаниям, и не до­ пуская попадания кислорода в систему (особенно если анализи­ руются легко окисляемые соединения).

Силикагель обладает слабыми кислотными свойствами (рН 4) в результате наличия на поверхности ОН-групп, промышленные образцы иногда содержат следы сильных кислот, оставшихся после гелеобразования. В последнем случае кислоту можно удалить про­ мыванием водой (до нейтральной рН). Образцы, чрезвычайно чувствительные к слабым кислотам, можно разделять на силикагеле, если включить в состав растворителя буфер основного ха­ рактера. Окись алюминия и магния являются основными адсор­ бентами, обычная окись алюминия имеет рН поверхности около 12. Чувствительные к основаниям образцы нельзя разделять на окиси

стием образца. Кроме того, следует иметь в виду, что растворитель также может вступать в реакции в процессе хроматографирования. Например, при препаративном разделении на окиси алюминия в качестве растворителя нельзя использовать ацетон. В присутствии адсорбента основного характера ацетон полимеризуется в диацетоновый спирт и высококипящие продукты, которые затем загрязняют выделенные фракции образца.

В современной высокоэффективной ТЖХ меньше проблем, свя­ занных с реакциями образца при разделении, чем в ранее приме­ няемых методиках. Во-первых, длительность разделения теперь сократилась в 10—100 раз по сравнению с классическим ТЖХ-ме- тодом, а это значит, что во столько же раз сократилась длитель­ ность реакций. Следовательно, степень протекания реакции будет гораздо меньше, чем если в системе возможны реакции с участием образца. Во-вторых, при разделении на колонках предохранить

172 Глава 6

образец от воздействия воздуха и света гораздо легче, чем при ис­ пользовании тонкослойной хроматографии.

Необратимое удерживание части или всего образца в процессе разделения методом ТЖХ наблюдается редко, только для очень полярных образцов. В некоторых случаях этого можно избежать, если дезактивировать адсорбент водой или изменить систему растворителя. Флорисил (алюмосиликатный адсорбент), как из­ вестно, необратимо адсорбирует даже неполярные соединения. До­ бавление воды во флорисил незначительно сказывается на необра­ тимой адсорбции и потери образца.

О трудностях, вызываемых плохой воспроизводимостью партий адсорбента, уже говорилось ранее. Любой определенный тип ад­ сорбента, такой, как силикагель, может значительно изменять хроматографические характеристики в результате соответствующего изменения площади поверхности адсорбента и структуры пор или природы адсорбента (например, кристаллический или компози­ ционный). В наших экспериментах, особенно проводимых в настоя­ щее время, определенный выпускаемый промышленностью про­ дукт, такой, как порасил, будет показывать незначительные изме­ нения в свойствах от партии к партии. Однако эти свойства могут в широкой степени контролироваться небольшими изменениями в количестве добавленной воды в адсорбент (см. предыдущее обсуж­ дение).

адсорбированной воды. Дезактивация адсорбента может быть вы­ звана присутствием в образце (или растворителе) сильно адсорби­ рующихся примесей. Вследствие этого при повторном использова­ нии колонки последовательное заполнение адсорбента дезакгиви-'

с тем же адсорбентом, что и в основной колонке. «Предваритель­ ная» колонка помещается перед основной колонкой и периодически заменяется. В этом случае любые сильно адсорбирующие компо­ ненты остаются в «предварительной» колонке и отбрасываются прежде, чем они могут попасть в основную колонку. Если основная колонка дезактивируется этими сильно адсорбирующими компо­ нентами, обычно лучше избегать многократного использования колонки. Естественно, если на приготовление основной колонки за­ трачено много времени или средств, можно применить регенера­

Твердо-жидкостная хроматография 173

удаляется еще более слабым, и процесс повторяется до тех пор, пока не вернется к исходному растворителю (т. е. все активные растворители должны быть вымыты из колонки). После этого не­ обходимо восстановить адсорбент, т. е. скорректировать содержа­ ние воды, как описано выше.

Легко понять, что нестабильность работы колонки является ре­ зультатом изменения в содержании адсорбированной воды. В прин­ ципе будет достаточным тщательный контроль содержания воды в растворителе. На практике это может оказаться трудным, особен­ но для неполярных растворителей. В дальнейшем проблема услож­ няется ввиду медленной реакции колонки на любое преднамерен­ ное (или случайное) изменение содержания воды в растворителе. Если изменения содержания воды в растворителе определяются восстановлением первоначального содержания воды в адсорбенте, целесообразно делать только небольшие однократные изменения. Равновесие устанавливается в колонке в течение длительного вре­ мени. В случае необходимости можно провести повторное регули­ рование содержания воды в растворителе (после достижения рав­ новесия).

Д. Некоторые примеры применения твердо-жидкостной

хроматографии

Как уже отмечалось в разд. А, высокоэффективная (в разд. А «современная») ТЖХ все еще относительно редко используется на практике (в частности если судить по публикуемым сообщениям). Будет полезно рассмотреть два примера главным образом для того, чтобы проследить, как различные методы ЖТХ могут быть использованы на практике.

Первый пример был опубликован недавно в работе [11]. Раз­ бавленные растворы хинолина в додекане подвергались каталити­ ческому гидрированию, и необходимо было определить, какие по­ лучились продукты. Основной интерес представляли ароматические азотсодержащие соединения. Общая концентрация азота в продук­ тах гидрирования колеблется в пределах от 1000 до менее чем 1 ч. на млн. На рис. 6.5 показаны основные интересующие нас про­ дукты, хотя они не были известны в начале работы. Вначале был проведен качественный анализ основных продуктов образца. На­ чальное, поисковое разделение, цель которого — определить ком­ позиционный состав образца, целесообразно проводить методом градиентного элюирования. На рис. 6.6 показана хроматограмма, полученная при разделении типичных продуктов образца при гра­ диентной подаче растворителя (ТЖХ). Основные компоненты (они перенумерованы) собираются в средней части хроматограммы, не­ значительное число углеводородов (т. е. соединений, не содержа­ щих азота) вымывается в начале и незначительное количество бо­ лее полярных соединений в конце хроматографирования. Основные

соединения, показанные на рис. 6.6, были легко выделены препа­ ративным разделением с такой же градиентной подачей раствори­ теля. Идентификация каждого выделенного соединения была проведена методом ИК-спектроскопии, как показано на рис. 6.6. Вымываемые последними соединения также были охарактеризо­ ваны, в результате было установлено, что это не представляющие для нас интереса продукты глубокой перегруппировки.

Пик V-b на рис. 6.6 проявляется как неразрешенное плечо. Раз­ решение системы ТЖХ было увеличено использованием одного

Р и с . 6.5. Продукты гидрогенизации в разбавленном растворе хинолина.

растворителя * оптимальной активности, более длинной колонки и медленной скорости потока растворителя. На рис. 6.7 показано полученное разделение пика V-b, где между пиками IV и I наблю­ дается три четких пика.

После того как было установлено, какие продукты образуются при гидрировании хинолина, необходимо было проанализировать несколько сот образцов с целью обнаружения в них интересующих нас соединений: I , I I , I I I , IV, V-a и V-b. Детальное разделение пика V-b на его три компоненты не считалось необходимым. В ре­

этих образцов и сокращало длительность анализа каждого образ­

ное разрешение всех интересующих пиков позволяет легко осуще­ ствить их количественный анализ.

Время, мин

Ри с. 6.6. Разделение образца гидрированного хинолина методом градиентного элюирования на окиси алюминия [11].

Другим примером применения ТЖХ может служить определе­ ние антиоксидантов, присутствующих в неизвестных образцах (так называемые конкурентные продукты); эта работа не публикова­ лась. На рис. 6.9 и 6.10 показано разделение некоторых типичных

антиоксидантов на двух различных колонках для твердо-жидкост­ ной хроматографии. Неполярные антиоксиданты хорошо разре­ шаются на системе, приведенной на рис. 6.9, в то время как по­ лярные антиоксиданты требуют длительного элюирования. Так,

Растворитепъ

178 Глава 6

полярные антиоксиданты хорошо разрешены на колонке с корасилом I I (рис. 6.10), где неполярные антиоксиданты быстро вымы­ ваются в виде неразрешенного пика. Используя метод сборных колонок (гл. 4), можно создать систему, отвечающую и тем и дру­ гим требованиям.

В данном случае (рис. 6.11) используется перегруппировка ко­ лонок. Применяется постоянное давление, программируемый поток

второго трехходового крана меняют путь потока, следующего через колонки I и I I . Компоненты, вначале удерживаемые на колонке I I (антиоксиданты средней полярности), быстро вымываются из нее, так как эта колонка коротка, а скорость потока относительно вы­

вымываются (колонка относительно длинная, а скорость потока мала). При этих условиях слабо удерживаемые компоненты хо­ рошо разрешимы.

Результирующее разделение смеси антиоксидантов (рис. 6.9 и 6.10) показано на рис. 6.12. В пределах доступного времени на­ блюдается адекватное разделение всех шести компонентов. Подоб­ ное разделение полимерного экстракта показано на рис. 6.13. На этой хроматограмме видно по крайней мере девять ароматических соединений, два из которых идентифицированы как антиоксиданты.

СП И С ОК Л И Т Е Р А Т У Р Ы

1.Snyder L . R., J. Chromatog. Sci., 7, 352 (1969).

2.Stahl E., Thin-Layer Chromatography: A Laboratory Handbook, 2nd ed., Aca­ demic Press, New York, 1969.

3.Morris L . J., Nichols B. W., in «Chromatography», 2nd ed., Heftmann E., ed., Reinhold, New York, 1967, p. 466.

4.Snyder L . R., Anal. Chem., 39, 698 (1967).

5.Snyder L . R., Principles of Adsorption Chromatography, Marcel Dekker, New York, 1968.

6.Snyder L . R., J. Chromatog., 8, 319 (1962).

7.Snyder L . R., J. Chromatog., 17, 73 (1965).

8.Snyder L . R., J. Chromatog., 20, 463 (1965).

9.Snyder L . R., Accounts Chem. Res., 3, 290 (1970).

10.Snyder L . R., J. Chromatog. Sci., 7, 195 (1969).

11.Snyder L . R., J. Chromatog. Sci., 7, 595 (1969).

12.Wrmn J. J., Szczepanowa A. D., J. Chromatog., 14, 405 (1964),

Глава 7

ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

К.Бомба

А.Теория эксклюзионной хроматографии Эксклюзионная, или гель-проникающая, хроматография (ГПХ)

является одной из форм жидкостной хроматографии, в которой разделение происходит в результате того, что молекулы образца проникают внутрь заполненных растворителем пор насадки и за­ держиваются там на разное время. Молекулы, имеющие в рас­ творе большой размер, или не проникают совсем, или проникают

только в часть пор геля и вымываются из колонки раньше, чем маленькие молекулы, вследствие чего обеспечивается разделение по размеру; который имеют молекулы образца в растворе.

Разделение может быть описано классическим уравнением хро­ матографии:

где VM — мертвый, или транспортный, объем колонки (промежу­ точный объем); Vs—объем растворителя, заключенного в порах насадки; Ко = K(VfS/Vs)— доля объема неподвижной фазы, до­ ступного для молекул растворителя, деленная на объем неподвиж­ ной фазы; К— концентрация в неподвижной фазе [2], деленная на концентрацию в подвижной фазе. На рис. 7.1 показано, как про­ исходит разделение..