книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

Associates, Framingham. Mass»), обычные хроматографические но­ сители, ионообменная смола пеллекс («Northgate Laboratories, Hamden, Conn.») и пористое стекло («Corning Glass, Corning, N. Y.»), используемое в эксклюзионной хроматографии. Хотя при сухом спо­ собе заполнения вручную можно изготовить великолепные колонки, их эффективность зависит от опытности экспериментатора.

Ю

На рис. 2.12 показана схема универсального устройства для автоматической упаковки одиночных колонок. Достаточное для за­ полнения колонок количество насадки помещается в питательное устройство и медленно поступает в колонку, в то время как дер­ жатель, к которому колонка прикреплена, поднимается верти­ кально штоком, соединенным с вращающейся осью мотора, и затем падает на металлический стопор. Питательное устройство должно быть контейнером с таким узким отверстием в дне, чтобы насадка поступала медленно. Подача обычно осуществляется при переме­ шивании или вибрации насадки в питателе, чтобы предотвратить

забивание отверстия. Когда колонка заполнена, ввод в нее закры­ вают фильтром, чтобы удержать насадку, и надевают соединитель­ ное устройство для совмещения колонки с камерой ввода или краном ввода образца. Устройство для заполнения колонки может быть спроектировано таким образом, чтобы менялись и частота, и амплитуда ударов, оптимизируя эффективность колонки. Верти­ кальная установка колонки проверяется по отвесу, а для обеспече­ ния бесшумной работы вся установка может быть отгорожена и изолирована.

Суспензионное заполнение. Если заполняющие колонку мате­ риалы нельзя упаковать сухим способом, применяют суспензион­ ный метод. В гл. 7 указывается, что суспензионным способом по­ мещают в колонки насадки, применяемые в хроматографии, напри­ мер стирогель («Waters Associates, Framingham, Mass.») или бионасадки («Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.»), так как в растворителе они набухают. Ионообменные смолы (см. гл. 8) также следует упаковывать суспензионным способом из-за их набухаемости. Даже см-олы с большим числом поперечных связей, которые имеют низкую набухаемость, приходится упаковывать сус­ пензионным способом. В работе [13] показано также преимущество использования метода сбалансированной плотности суспензии для заполнения колонок материалом с химически связанными непо­ движными фазами (см. гл. 5).

В литературе опубликованы подробные методики заполнения колонок для эксклюзионной [14] и ионообменной хроматографии [15]. На рис. 2.13 показана основная аппаратура, используемая для суспензионного заполнения.

Е. Термостаты колонок

Термостат колонки должен иметь соответствующие размеры, чтобы в него можно было поместить колонку любой требуемой длины и диаметра; он должен быть достаточно большим, чтобы в случае необходимости можно было пользоваться и сравнительной колонкой или даже серией колонок. Когда проектируется термо­ стат для жидкостной хроматографии, для определения точности контроля температуры необходимо учитывать теплоемкость цир­ кулирующей среды и скорость ее циркуляции. Воздух имеет низкую теплоемкость, но скорость его циркуляции может быть очень боль­ шой, так что во многих случаях воздушные термостаты могут обеспечить лучший температурный контроль с меньшими трудно­ стями, чем жидкостные бани.

/.Воздушный термостат

Восновном в жидкостной хроматографии проблема темпера­ турного контроля та же, что и в газовой. Причины необходимости тщательного температурного контроля обсуждаются в других

62 Глава 2

главах. Хотя теплоемкость жидкой подвижной фазы значительно выше, чем у газовой, в высокоэффективных жидкостных хроматографических колонках имеется очень мало подвижной фазы, и так же как и в газовой хроматографии, систему будут определять теп­ лоемкость колонки и насадки. По этой причине воздушные термо­ статы, используемые в газовой хроматографии, могут применяться и в жидкостной хроматографии. Термостат и пропорциональное

стали колебание температур значительно меньше 1%. Если объем­ ная скорость подвижной фазы большая, как в случае препаратив­ ных колонок большого диаметра, или если рабочая температура высокая, то чтобы подвижная фаза термостатировалась прежде, чем достигнет колонки, в термостат можно поместить уравновеши­ вающую спираль — трубку из нержавеющей стали длиной около 4,5 м и диаметром 1,5 мм.

Воздушные термостаты имеют преимущество над водяными в том, что они менее инерционны, в них легче изменить рабочую тем­ пературу. Воздушные термостаты также более удобны, когда тре­ буется сменить колонки или удалить течь.

При использовании горючего растворителя, например гексана, воздушный термостат перед включением нагрева необходимо про­

2. Водяной термостат

Единственным существенным достоинством водяного термостата применительно к жидкостной хроматографии .является то, что он в большинстве случаев легко доступен. Поддерживать требуемую температуру достаточно просто: в рубашке колонки циркулирует жидкость из термостата. Скотт [16] описал водяной термостат, ис­ пользуемый для температурного программирования в жидкостной хроматографии.

с минимальным уширением хроматографической полосы обычно может быть достигнуто за несколько минут. В связи с этим пики удобно собирать вручную. Чтобы направлять подвижную фазу в пробирку коллектора, на выходе из детектора можно поставить простой трехходовой кран. Кран коллектора фракций должен хо­ рошо промываться и иметь маленький внутренний объем. Трубка,

соединяющая кран с детектором, должна иметь маленький вну­ тренний диаметр и быть как можно короче, чтобы анализируемое вещество оказалось в коллекторе фракций через несколько секунд после детектирования.

2. Автоматический коллектор

Автоматический непрерывный коллектор фракций помещают на выходе из жидкостной хроматографической колонки для сбора фракций элюата в препаративной работе или для дополнительных аналитических исследований. Хороший коллектор фракций необхо­ дим, если нет непрерывных детекторов, и некоторые свойства со­ бранных фракций (поглощение, радиоактивность и др.) должны быть измерены как функция времени или объема подвижной фазы. Однако необходимость в коллекторах фракций снизилась после того, как были разработаны чувствительные детекторы, непрерывно измеряющие поток элюента и автоматически регистрирующие время, когда соединение покидает колонку.

3.Устройства для измерения скорости потока

Вжидкостной хроматографии чрезвычайно важно измерять скорости потока, так как надежный качественный и количествен­ ный анализ затруднен, если скорость потока не постоянна. В эксклюзионной хроматографии важно измерение потока для опреде­ ления удерживаемого объема образца, потому что удерживаемый

объем пропорционален логарифму молекулярного веса образца.

на прозрачной части трубки. Объем трубки между точками, ко­

двумя фоточувствительными элементами, пузырек автоматически включает и выключает реле времени. Поскольку объем стеклянной трубки известен, то, зная время прохождения пузырька, можно определить скорость потока. При использовании такого отметчика не нужно калибровать трубку для каждого растворителя. Точность определения составляет примерно 1%, т. е. вполне приемлема для большинства определений, проводимых методом жидкостной хро­ матографии.

2. Объемный метод

Для измерения потока также часто используется объемный ме­ тод, в котором подвижная фаза на протяжении известного отрезка времени собирается в калиброванный сосуд. Этот метод удобен тем, что оборудование для измерения объема может быть уста­ новлено рядом с хроматографом или даже встроено в него. Сифон­ ный счетчик («Waters Associates, Framingham, Mass.»)—автома­ тическое устройство для измерения объема, которое часто исполь­ зуется в эксклюзионной хроматографии и дает полунепрерывную запись скорости потока на ленте самописца. Сосуд малого объема (обычно 5 мл) заполняется подвижной фазой до определенного уровня выше линии стока и затем освобождается сифонированием. Вытекающая жидкость включает фоточувствительную цепь, кото­ рая подает сигнал на самописец (см. рис. 10.24 и 10.25). Точность определения скорости потока таким методом составляет ± 1 % .

3.Расходомер

Наиболее удобным, но не достаточно точным устройством для измерения потока является расходомер. В расходомере исполь­ зуется сопротивление трения подвижной фазы при подъеме шарика вертикально в калиброванной стеклянной трубке; он дает непре­ рывную индикацию потока. Этот метод, широко применяемый в га­ зовой хроматографии, в жидкостной хроматографии не удобен, так как из-за больших различий в вязкости растворителя необходимо проводить калибровку для каждой подвижной фазы. Тем не менее целесообразно включить расходомер в систему, поскольку по его показаниям можно сразу полуколичественно определить скорость потока в системе. Если расходомер поместить в поток, не содер­ жащий масла и грязи, то точность определения скорости потока составит примерно 5%.

4. Весовой метод

Наиболее точным методом определения расхода является гра­ виметрический метод: в течение известного промежутка времени подвижная фаза собирается и затем взвешивается. Однако этот метод редко используется на практике, так как требует много вре­ мени и не обеспечивает непрерывной записи расхода. Гравиметри­ ческие методы благодаря своей точности используются при оценке стабильности работы насосов.

И. Градиентное элюирование

Градиентное элюирование или программирование растворителя широко используется в адсорбционной и ионообменной хромато­ графии и, безусловно, найдет применение и в распределительной

ны подвижной фазы и оптимизации разделения при статических условиях. Состав подвижной фазы можно быстро изменить, для этого достаточно изменить относительн>ю скорость подачи из двух резервуаров и поддерживать ее постоянной. Этим способом в короткое время можно провести анализ многих постоянных со­ ставов при малом расходе растворителя. На рис. 2.14 показаны хроматограммы, полученные при использовании градиентного устройства (фирмы «Е. I . du Pont de Nemours Instrument Products Div., Wilmington, Del.»), позволяющего осуществлять быстрое по­ шаговое изменение состава подвижной фазы и оптимизацию раз­ деления некоторых галогенированных бензолов. Для изменения со­ става подвижной фазы в этих условиях требуется менее 5 мин. Оптимизировав таким способом разделение, можно начать обычный анализ, используя один резервуар, содержащий оптимальную смесь, и один насос для подачи растворителя.

3. Промышленное оборудование для градиентной подачи растворителя

Большинство фирм, изготовляющих высокоскоростные жидкост­ ные хроматографы, предлагают устройства для градиентного элюирования как дополнение к своим приборам. Схематические диаг­ раммы таких систем показаны на рис. 2.15а—2.15г. В градиентных

смешения низкого давления, жидкость измененного состава по­ дается в колонку с помощью возвратно-поступательного насоса ма­ лого объема.

В градиентных устройствах, представленных на рис. 2.15в и 2.15г, растворители смешиваются при высоком давлении. В первом применяются два насоса высокого давления винтовой подачи и жидкостная камера второго насоса используется как камера смеше­ ния. Во втором используется один пневматический насос высокого давления, удерживающая спираль и два крана, регулирующих

смешение растворителей, поступающих из двух резервуаров. На рис. 2.16 показано разделение некоторых хлорированных производ­ ных бензолов при постоянном составе подвижной фазы и с про-

~: А -

—L —

г

граммированием растворителя градиентной системой, приведенной на рис. 2.15г. Заметим, что при градиентной подаче пики, вымывае­ мые последними, достаточно узки, и вымывание их можно прово­ дить гораздо быстрее без ущерба в разрешении уже полученных пиков.