книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

с очень малым размером зерен и были получены поверхностно-по­ ристые и макросетчатые смолы.

2, Выбор ионообменных смол

В большинстве случаев удовлетворительные результаты могут быть получены с одним из наиболее общих типов смол, таким, как сульфированная катионообменная смола или анионообменная смо­ ла с четвертичными аммонийными группами. Слабокислотные и слабоосновные смолы редко используются в хроматографии не­ органических веществ, однако они полезны при разделении орга­ нических соединений.

Сильнокислотные катионообменники адсорбируют все катионы, которые могут проникать в матрицу геля. Сюда включается ад­ сорбция катионов из солей сильных и слабых кислот, а также катионов сильных и слабых оснований. Такие смолы можно эффек­ тивно использовать в элютивной хроматографии в Н+ -форме или в солевой форме. Сильноосновные анионообменники могут адсор­ бировать анионы из солей сильных и слабых оснований, могут

Слабокислотные катионообменники не удаляют катионы из растворов солей сильных кислот; они адсорбируют катионы из рас­ творов сильных и умеренно сильных оснований, и их можно ис­ пользовать с щелочными или нейтральными растворами. Слабо­ основные анионообменники не удаляют анионы из растворов солей сильных оснований; они адсорбируют анионы из растворов силь­ ных и умеренно сильных кислот, удаляют анионы из солей, обра­ зованных слабыми основаниями, и могут использоваться в ней­ тральных и кислых средах.

Выбор ионообменной смолы определяется свойствами отдель­ ных компонентов образца. Если свойства раствора изменяются при варьировании рН или других параметров, результирующая химическая система может быть настолько изменена, что для ее разделения потребуются различные ионообменные среды. Не пы­ таясь вывести какое-то общее правило выбора смолы, мы приведем далее (разд. Е) несколько примеров хроматографического разде­ ления различных сред, систем и методов.

3. Выбор растворителя

Основные хроматографические разделения с использованием ионообменных смол производят в водных растворах, учитывая пре­ красные растворяющие и ионизирующие свойства воды. Однако используются и смешанные растворители, такие, как вода/метанол.

Часто для оптимального вымывания необходимо использовать кон­ курирующие ионы растворителя, оставляя в то же время постоян­ ным рН растворителя. Для этой цели можно использовать водные буферные растворы (ацетат аммония/уксусная кислота) различ­ ных концентраций.

4. Размеры колонки

Размеры колонки оказывают значительное влияние на разре­ шение или разделение, достигаемое в ионообменной колонке. Уве­ личение длины колонки улучшает эффективность разрешения двух компонентов с сопровождающимся увеличением ширины пика. Диаметр колонки мало влияет на разрешение (предполагается, что скорости потоков сравнимы и используется пропорционально уве­ личенный образец) до тех пор, пока колонка не становится на­ столько широкой, что в ней становятся возможными поперечные отклонения в свойствах потока, или не настолько узкой, чтобы требуемый размер образца был таким малым, чтобы разделяемые компоненты нельзя было бы детектировать регистрирующей систе­ мой прибора. В большинстве аналитических систем используются колонки диаметром от 0,1 до 1,0 см. В некоторых препаративных системах, где допускается снижение разрешения, применяются ко­ лонки большего диаметра.

5. Размер зерен смолы

Желательно использовать сферические зерна смолы с узким диапазоном по размеру и наименьшим размером, совместимым с оборудованием хроматографической системы. Очень маленькие ча­ стицы смолы имеют низкое сопротивление массопереносу в твер­ дой фазе, и это позволяет приблизиться к истинному равновесию. Во многих аналитических ионообменных системах теперь приме­ няют частицы смолы диаметром менее 40 мкм, становится обще­ принятым использование смол с размером частиц около 10 мкм [6, 7]. Вероятно, нижний предел диаметра частиц равен 2—3 мкм, меньшие частицы уже образуют коллоидную суспензию.

6.Использование

Хотя с помощью различных типов жидкостной хроматографии можно решать самые различные задачи, ионообменная хромато­ графия является простейшим и наиболее эффективным способом разделения ионных веществ и именно этим методом пользуются в тех случаях, когда необходимо применять водные растворители. Это особенно важно для решения многих биохимических проблем, так как использование водных хроматографических систем уп­ рощает приготовление образца. Ионообменную хроматографию

логично применять также для анализа очень сложных смесей, так как специфичность многих ионообменных материалов позволяет разделять на одной колонке буквально сотни соединений различ­ ного типа [5—8].

Безусловно, метод ионообменной хроматографии не лишен не­ достатков. Так, это не лучший способ разделения веществ, раство­ римых в органических растворителях. Массоперенос в жидкостной системе протекает относительно медленно и обычно определяет скорость сорбционных процессов. Это, вероятно, самый большой недостаток, присущий методу жидкостной хроматографии в целом. Кроме того, массоперенос внутри самих частиц смолы происходит крайне медленно. Таким образом, в силу указанных причин разде­ ление методом ионообменной хроматографии требует больше времени, чем разделение другими хроматографическими методами, например методом газовой хроматографии. Однако при при­ менении поверхностно-пористых и макросетчатых смол влияние массопереноса снижается, что позволяет решить некоторые проб­ лемы [21].

К числу других недостатков, характерных в большей или мень­ шей степени для всех разделительных систем, относятся: невос­ производимость ионообменных насадок; незнание механизмов сорбции, связанных с многими разделениями (что требует эмпири­ ческих подходов к конструкции системы); отсутствие подходящего, надежного и дешевого промышленного прибора, который позволил бы сделать этот метод стандартным.

Д. Ионообменные смолы и их обработка

Последнее время ионообменные синтетические смолы изготов­ ляются в больших количествах многими фирмами. В основном эти смолы используются для водоочистки. В последние годы некото­ рые компании для использования в хроматографических системах предварительно очищают промышленные смолы. Некоторые из этих компаний выпускают собственные ионообменные материалы (см. табл. 8.1). Обширный перечень фирм, производящих ионооб­ менные смолы и типы доступных смол, дан в ряде ссылок реко­ мендуемой литературы в конце главы.

Для хроматографического разделения требуются смолы анали­ тического класса. Если смолы требуемого класса или чистоты не выпускаются промышленностью, можно взять смолу промышлен­ ного класса и соответствующим образом обработать, чтобы уда-

Ионообменная хроматография 223

лить примеси. Эта обработка включает интенсивное промывание

цами (диаметром больше 100 мкм) можно выполнить следующим образом. Смолу помещают в колонку и пропускают через нее мою­ щий раствор до тех пор, пока в элюате не будет наблюдаться детектируемых изменений. Смолы с частицами малого размера тщательно перемешивают с моющим раствором до образования суспензии, отфильтровывают и промывают дистиллированной во­ дой.

Катионообменные смолы обычно производятся в Н+ - или Na+ - форме, а анионообменные смолы — в Ch-форме. Время от вре­ мени, однако, желательно модифицировать эти смолы, чтобы их можно было использовать в различных ионных формах. Как пра­ вило, ионная форма смолы может измениться, если смола нахо­ дится в контакте с водным раствором, содержащим необходимые катионы или анионы в высокой концентрации. В зависимости от размера частиц смолу или помещают в колонку и пропускают через нее реагент до тех пор, пока не произойдет полного пре­

Свойства ионообменных смол часто различаются от партии к партии; объясняется это несовершенством технологии их получе­ ния. Еще несколько лет назад исследователь, использующий ионо­ обменную хроматографию, получая небольшое количество смолы, которая давала ему возможность достигнуть сложного или не­ обычного разделения, позднее горевал, что не может получить больше точно такой смолы, а ни с одной другой ему не удается воспроизвести результаты. Сейчас положение улучшилось, хотя от­ клонения в свойствах смолы от партии к партии все еще наблю­ даются.

Само собой разумеется, что необходимо разработать метод определения основных свойств смолы. Необходим также метод, связывающий физические свойства (например, размер частиц, тип активной группы и степень сшивания) смолы с ее разделитель­ ными характеристиками. Некоторые интересные результаты в этом отношении опубликованы в работе [9].

3. Размер частиц смолы

Одной из наиболее важных физических характеристик ионооб­ менной смолы является размер ее частиц. В системах с самым высоким разрешением используются смолы сферической формы с средним диаметром частиц меньше 20 мкм. Важно, чтобы ча­ стицы имели одинаковые размеры (т. е. диапазон размеров был

достаточно узким), так как это делает поток однородным и сни­ жает сопротивление колонки.

Если диаметр частиц смолы превышает примерно 40 мкм, то такие частицы можно разделить на узкие фракции с помощью

смолой, вымывает малые частицы, в то время как большие части­ цы опускаются на дно камеры. Используя эту методику, можно разделить смолы на фракции, внутри которых частицы будут от­ личаться по размерам на ± 1 мкм.

Если аналитический метод не нужно автоматизировать и если используются относительно большие частицы смолы, в качестве ионообменной колонки можно использовать обычную бюретку. Пробка из хлопка или стеклянной ваты будет предохранять на­ садку. Диаметр такой колонки не должен превышать 10 мм, и если используется поток, движущийся за счет силы тяжести, длина колонки не должна превышать 50 см (рис. 8.5).

Большинство используемых в настоящее время современных ионообменных методик предусматривает использование насоса для подачи элюента на колонку. Если сопротивление слоя смолы боль­ шое, выбор хроматографической системы должен быть произведен особенно тщательно. Некоторые фирмы, например «Chromatronix, Inc.» и «Metaloglass, 1пс.» выпускают ионообменные колонки с пористыми фильтрами, помещенными на входе и на выходе элю­ ента.

Выпускаются стеклянные колонки, выдерживающие высокое давление, вплоть до 70 атм. Эти колонки имеют внутренний диа­ метр 0,9 см и длину до 150 см. В тех случаях, когда необходимо более высокое давление, используются металлические колонки, их легко изготовить из трубок из нержавеющей стали (рис. 8.5). На входе и на выходе из колонки помещают стандартные уплотнения, а для удерживания слоя смолы используют пористые металличе­ ские фильтры.

б. Заполнение колонок смолой

Хотя заполнение хроматографических колонок ионообменными смолами требует меньше предосторожностей, чем это необходимо для других типов неподвижных фаз, ему следует уделять доста­ точное внимание. Стандартный метод заполнения колонок ионооб­ менными смолами с относительно большими частицами близкого размера предусматривает следующие операции: 1) приготавли­ вают суспензию из частичек смолы, 2) вводят ее внутрь колонки или камеры, присоединенной к колонке, 3) дают частицам смолы осесть. Отстоявшийся слой жидкости удаляют, если это необходи-

228 Глава 8

При динамическом заполнении частицы ионообменной смолы, находящиеся в текущей жидкости, принудительно направляются в слой насадки со скоростью, гораздо большей скорости их оседа­ ния. Динамическое заполнение может осуществляться двумя пу­ тями: 1) вытеснением густой суспензии или 2) экструдированием предварительно упа­ кованного слоя. В первом случае с хрома­ тографической колонкой соединяют камеру или резервуар, заполняют ее густой суспен­ зией ионообменной смолы и затем переме­ щают суспензию внутрь колонки. С этой целью в камеру поверх суспензии с по­ мощью насоса подают жидкость (рис. 8.6).

Если линейная скорость вытесняющей жид­ кости в камере суспензии значительно больше скорости оседания больших частиц, в упакованном слое не будет наблюдаться разделения частиц по размеру. Упаковку смолы следует проводить при такой скоро­

связаны с большим сопротивлением (в длинных колонках), пре­ пятствующих быстрому перемещению суспензии из суспензионной

Ионообменная хроматография 229

Заполнение методом экструзии можно также использовать для упаковки колонок спиральной формы; полученная при этом на­

6. Ь'равноевшивание

Прежде чем начинать хроматографическое разделение, запол­ няющую колонку ионообменную смолу приводят в состояние рав­ новесия с элюентом. Эта процедура может занять несколько часов, особенно если смола предварительно находилась в состоянии рав­ новесия с раствором, ионная сила которого значительно отлича­ ется от ионной силы элюента.

Ионообменные смолы можно использовать много раз для одних и тех же разделений, прежде чем их обменная емкость резко по­ низится. Если условия опыта постоянны во время всего анализа, колонка годится для следующих опытов сразу после элюирования последнего вещества. Однако если проводится градиентное элюирование или применяется температурное программирование, смолу необходимо заново привести в состояние равновесия с элюентом при начальных условиях и только после этого использовать для последующих опытов.

7. Время жизни колонок

Время жизни колонок в аналитической системе может состав­ лять 6 месяцев. Это значит, что на одной колонке без замены смолы можно провести сотни простых хроматографических разде­ лений. Если некоторые из содержащихся в образце веществ сор­ бируются необратимо (как, например, в некоторых биохимических системах), непосредственно перед основной колонкой помещают небольшую «предварительную» колонку или патрон из ионообмен­ ной смолы, эффективно задерживающий эти вещества. «Предвари­ тельную» колонку после нескольких опытов заменяют.

8. Ввод образца

Образец или питательный раствор могут быть введены в ко­ лонку двумя путями в зависимости от того, как производится раз­ деление. В препаративной хроматографии, когда необходимо про­ вести разделение большого объема раствора, компоненты которых удерживаются удовлетворительно, питательный раствор можно просто подавать с помощью насоса на хроматографическую колон­ ку. Затем для разделения и вымывания отдельных компонентов используются различные элюенты.