книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

изменяется в 10 раз. Эту аномалию необходимо учитывать при определении хроматографическим методом размера молекул.

Влияние температуры. Повышать температуру при разделении методом ГПХ приходится потому, что не все исследуемые соеди­ нения растворимы при комнатной температуре; это, например, полиолефины, полиэфиры и некоторые полиамиды, нерастворимые в трифторэтаноле. Фактически все другие вещества могут быть рас­ творены при комнатной температуре. Однако при повышении тем­ пературы снижается вязкость растворов и усиливается молекуляр­ ная диффузия, что приводит к увеличению разрешения или ско­ рости.

В. Разделение полимергомологов методом гель-проникающей хроматографии высокого разрешения

кромолекул. В последнее время этот метод стал применяться в промышленности для определения молекулярного веса и молекулярновесового распределения полимеров, а также при изучении син­ теза [24], переработки [25] и деструкции полимеров [26]. Однако в равной степени ГПХ можно использовать и при работе с низко­ молекулярными веществами, такими, как олигомеры, мономеры и многие неполимерные соединения. Действительно, методом ГПХ может быть получено наивысшее разрешение в низкомолекуляр­ ном диапазоне. Это можно видеть на примере разделения тригли­ церидов (рис. 7.11). При разделении веществ, молекулярный вес которых отличается на (IsMw = 40), наивысшее разрешение про­ является при вымывании низкомолекулярных соединений (высокие k'). Методом ГПХ можно разделить сколь угодно малые моле­ кулы. Хендриксон [11] провел разделение методом ГПХ легких

ства для разделения полимергомологов требуется все большее раз­ решение. Это хорошо видно на примере разделения углеводородов,

просто предсказать емкость пика и разрешающую способность си­ стемы [8].

Приведенная на рис. 7.13 калибровочная кривая прежде всего показывает, что молекулярный вес углеводородов и триглицеридов

связаны линейно с VR. Известно, что ширина пиков в этой системе равна 14 мл, поэтому можно измерить емкость пиков в системе и предсказать вполне надежно место, где будет элюироваться ком­ понент определенного молекулярного веса. И наоборот, пик, элюирующийся при известном элюентном объеме, может быть связан с достаточной точностью с молекулярным весом. Если последую­ щее разделение многокомпонентных фракций производится после

1

адсорбционного анализа, исследователь может утверждать, что, поскольку все компоненты фракций вымыты при одном и том же элюентном объеме, они имеют близкие молекулярные веса.

7.12, были проведены на дорогостоящих сравнительно длинных ко­ лонках с стирогелем. Вместо того чтобы увеличивать длину колон­ ки, повысить разрешение можно с помощью рецикла [9, 27]. В ГПХ это вполне возможно, так как значение Ко не превышает 1. В ре­ зультате максимальный объем элюирования определяется емко­ стью системы. Нет надобности рассматривать последние пики, как в обыкновенной сорбционной хроматографии. Разделение углево­ дородов Си—Ci6, показанное на рис. 7.14, было проведено в 20 цик­ лов при скорости элюента 3 мл/мин на колонке длиной 4,8 м. По сравнению со 48-метровой системой эта колонка была в 10 раз короче, скорость потока — в 7,5 раза выше и за счет рецикла дли­ тельность разделения — в 10 раз меньше. Следовательно, при применении рецикла эффективная длина колонки возросла в 10 раз без увеличения перепада давления.

объем. На практике для системы с рециклом межколоночное уши-

Дополнительное опасение возникает из-за того, что система ре­ цикла является закрытой системой с конечным объемом; следова­ тельно, быстро двигающиеся компоненты будут в конце концов

(4Х)

АдСи Л ( 4 Х , С

достигать медленно двигающиеся и смешиваться. Чтобы избежать перекрывания пиков, в системе должно быть предусмотрено устрой­ ство, позволяющее оператору удалять часть компонентов прежде, чем наступит перекрывание [29]. Это иллюстрируется на хроматограмме рис. 7.16, где тритон Х-45 пропущен в шесть циклов. По­ скольку низкомолекулярный компонент элюируется первым, жела­ тельно удалить разрешенные компоненты и продолжать рецикл с оставшимися компонентами до полного их разрешения. Для обес­ печения точности этого удаления, очевидно, необходимо рецикл образца осуществлять через детектор.

Ширина пика увеличивается с ростом длины колонки и, ис­ пользуя эту зависимость, можно рассчитать увеличение ширины пика с числом циклов. Ширина пика на определенном цикле опи­ сывается уравнением

Щп = ™о (Y»)V'.

где Yn — номер цикла. Расстояние между пиками является функ­ цией числа циклов, поэтому ширина участка неразрешенной смеси на определенном цикле становится равной

Максимальное число циклов, таким образом, определяется началь­ ной емкостью системы и шириной распределения образца [29, 30].

Чтобы предупредить перекрывание, необходимо или удалить часть компонентов, как говорилось ранее, или увеличить длину колонки. Обычно предпочтительней удалить компоненты с высокими k', где разрешение самое большое. (В ГПХ наивысшие k' показывают соединения с самым низким молекулярным весом.)

Цикл 1

возрастает, концентрация вещества в растворителе понижается, что приводит к снижению чувствительности детектора. В итоге, чтобы компенсировать снижение чувствительности, сопровождаю­ щее увеличение эффективной длины колонки за счет рецикла, мо­ жет оказаться необходимым увеличивать величину пробы.

Влияние рецикла на разрешение при больших пробах. В пре­ паративной хроматографии применение рецикла дает определен­ ные преимущества. Влияние загрузки образца на разрешение по­ казано на рис. 7.17 и 7.18. Загрузка в колонку с внутренним диа­ метром 60 мм 5-граммового образца приводит к очень сильным искажениям пиков, которые могут быть ошибочно приняты за тримодальное распределение (рис. 7.18). Только после трех циклов образец разрешается как правильная бимодальная смесь. Длина колонки определяется необходимостью получения требуемого раз­ деления. Более полные данные, показывающие влияние размера пробы на разрешение вплоть до трех циклов, даны на рис. 7.19.

ное же влияние на разрешение оказывает и скорость потока. При-

Rs "l,05

150 (25 100

ремя, мин

веденные на рис. 7.20 данные показывают связь между разреше­ нием и скоростью потока для каждого из трех циклов. Разрешение при скорости потока 120 мл/мин после трех циклов сравнимо с разрешением при 14 мл/мин после одного цикла. Увеличение С К О ­

кость системы обеспечивает требуемое разрешение до появления перекрывания и если оборудование позволяет следить и осуществ­ лять необходимое удаление фракций. Иногда, наоборот, полезно снизить скорость потока, чтобы повысить разрешение, достигаемое за 1 цикл, и оставить систему рецикла на ночь без наблюдения, если можно пропустить 4—5 циклов без перекрывания. В этом случае на колонке получается максимальное разрешение за цикл.

1,6

208 Глава 7

Хотя этот метод и требует увеличения времени, он позволяет оставлять установку на ночь без наблюдения, что увеличивает производительность установки.

На рис. 7.21 показана схема системы рецикла. Эта система по­ зволяет осуществлять рецикл и поэтапное удаление фракций, как

это было описано. Конструкция установки такова, что ее можно промывать струей жидкости, в том числе и Т-образный ввод и сое­ динительные трубки. Система ввода пробы может содержать следы образца, которые будут повторно вводиться в чистый раствори­ тель при рецикле и будут проявляться как ложные пики.

Г. Интерпретация гель-проникающих хроматограмм

Гель-проникающая хроматография используется в основном как метод определения молекулярновесового распределения полимер­ ных веществ, в то время как гель-фильтрационная хроматография является главным образом методом препаративного разделения, но и в том и в другом случае пригодны обе методики. При опреде­ лении молекулярновесового распределения необходимо установить связь между хроматограммой и молекулярным размером или, пра­ вильнее, молекулярным весом. Сделать это можно с помощью калибровочной кривой. Если разрешение такое, что каждому ком­ поненту соответствует индивидуальный пик, соотношение будет до­ статочно строгим (рис. 7.13). Отклонения, как известно, прояв­ ляются в тех случаях, когда молярный объем или размеры молекулы в растворе не коррелируются с молекулярным весом.

При работе с полимерными системами разрешение на индиви­ дуальные полимергомологн получить не удается, да и в этом

Эксклюзионная хроматография 209

нет необходимости. Разработаны методики, успешно связывающие неразрешенную огибающую хроматограмму с выражением молекулярновесового распределения через калибровочную кривую. Предпочитаемый подход заключается в прямой калибровке ко­ лонок для ГПХ узкими стандартами известного молекулярного веса. Когда такие стандарты недоступны, обычно связывают мо­

скает отклонение, используется широко, так как он прост в при­ менении и позволяет установить требуемые соотношения при от­ сутствии точных калибровочных стандартов.

Интерпретация хроматограммы требует связи между удержи­

теля. Таким образом, если невозможно калибровать стандартами известного молекулярного веса, связь между Vn и средним моле­ кулярным весом в лучшем случае только приблизительная. Чтобы определять размеры молекул в растворе, необходимо учитывать дополнительный параметр, который бы при объединении с моле­ кулярным весом обеспечивал характеристический размер, связан­ ный с молекулярным радиусом вращения. Бенуа [33] предлагает использовать гидродинамический объем, равный произведению мо­ лекулярного веса на характеристическую вязкость. Характеристи­ ческая вязкость — это вязкость раствора, экстраполированная к бесконечному разбавлению. Бесконечное разбавление молекул рав­ ноценно условию нахождения вещества в правильно работающей гелевой колонке. Различная вязкость свидетельствует о том, что молекулы одного и того же молекулярного веса имеют различную пространственную конфигурацию.

И Бенуа [33], и Деврие [34] показали, что можно получить единую калибровочную кривую для полимеров различной компо­ зиционной и структурной конфигурации, если построить зависи­ мость гидродинамического объема от удерживаемого объема в ГПХ. Для маленьких неполимерных молекул молярный объем хорошо коррелируется с удерживаемым объемом [4, 31]. Молярный объем можно определить из экспериментальных измерений плот­ ности или установить при интересующей температуре с помощью ряда свойств. Хендриксон и Мур [5], предположив, что удерживае­ мый объем может быть связан с эффективным углеродным числом, эмпирически получили соотношение, в котором используется длина углерод-углеродной связи. Для оценки в единицах длины углеродуглеродной связи других связей был измерен удерживаемый объем для 130 соединений различного состава с различными функ­ циональными группами. При таком подходе необходимо соеди­ нить вместе вклад всех атомных группировок, чтобы получить эффективную длину цепи, для которой можно предсказать,