книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

Методы заполнения колонок зависят от природы геля. Полу­ жесткие гели, наиболее широко используемые в гель-проникающей хроматографии высокого разрешения, могут быть упакованы по методу, описанному Муром [22]. Частицы размером от 37 до 75 мкм суспендируются в некотором объеме смеси растворителей, напри­ мер перхлорэтилена и толуола, которая приготовляется в виде смеси с плотностью, равной плотности смолы. Полученная паста, имеющая одинаковую плотность, приводится в движение направ­ ляющимся внутрь колонки потоком растворителя и под действием такого уплотнителя упаковывается однородным слоем. Суспензия хранится в «предварительной» колонке, длина которой приблизи­ тельно в 1,5 раза превышает длину аналитической колонки. Рас­ творитель прокачивается со скоростью, достаточной для создания перепада давления в несколько десятков атмосфер. После уста­ новления постоянного давления растворитель пропускают через колонку до тех пор, пока гель не образует плотный равномерный слой. Оптимальное давление определяется эмпирически для каж­ дой партии геля.

ботку технологии заполнения собственных колонок. Заполненные колонки выпускает фирма «Waters Associates*, она же произво­ дит стирогель по лицензии «Dow Chemical Сотрапу». В габл. 7.4 приведены характеристики выпускаемых колонок.

4.Оборудование

Диаметр колонки. В ГПХ диаметры колонок больше обычно применяемых в распределительной или адсорбционной хромато­ графии; чаще всего внутренний диаметр колонки равен 7,2 мм. Еще первые работы показали, что с уменьшением диаметра ко­ лонки эффективность значительно падает и что совершенно не­ ожиданно с увеличением диаметра до величины, большей 50 мм, эффективность повышается. Препаративные колонки внутренним диаметром 60 мм, заполненные стирогелем, обычно имеют более 6000 тарелок на 1 м. Хайтц указывает, что работая с мягкими гелями, очень трудно получить высокую эффективность на колон­ ках диаметром 10 мм; однако на колонках диаметром 60 мм он получал эффективность больше 6000 тарелок на 1 м.

Следовательно, для получения высокого разрешения в ГПХ не­ обходимы колонки большого диаметра и большой длины, и по­ скольку используемая система подачи растворителя должна обес­ печивать заполнение требуемого объема колонки, оборудование хроматографической системы должно отвечать ряду специфических требований. Для этого необходимо использовать механические на­ сосы (непрерывного действия), если же применяются насосы шприцевого типа, то они должны обеспечить по крайней мере двух-, трехкратную замену объема колонки, чтобы исключить пульсацию во время подачи.

Большинство полимерных образцов следует вводить в виде 0,25— 1%-пых растворов. При больших концентрациях высокая вязкость раствора приводит к увеличению перепада давления и к неизбеж­ ному уширению пика из-за вязкого течения хвостовой части пика.

такие образцы не могут быть введены в находящуюся под высоким давлением систему обычным микролитровым (жидкостным) шпри­ цем. Однако при стандартной аналитической работе с небольшими молекулами (т. е. невязкими в концентрированных растворах) об­ разцы могут быть введены обычным способом с использованием микролитрового шприца. Ввод с помощью крана с петлей — стан­ дартный метод введения больших образцов в препаративной работе.

5. Условия работы

гели должны набухать в растворителе, так как размер пор мягкого

геля является функцией поглощенного растворителя. В идеальном случае движущийся растворитель, растворитель в порах и гель должны одинаково взаимодействовать с молекулой растворенного вещества, тогда перемещение ее внутри пор будет происходить только в результате диффузии. Однако на практике это требова­ ние выполняется не очень строго, как видно из данных табл. 7.5, где показаны растворители, наиболее часто используемые в гельпроникающей и гель-фильтрационной хроматографии. Например, N, N'-диметилформамид не отвечает описанным выше требованиям, тем не менее его часто используют с удовлетворительными резуль­ татами.

Таблица 7.56

Растворители, наиболее часто используемые в ГПХ I I . Данные по токсичности и взрывоопасности

Вязкость растворителя. Вязкость растворителя играет большую роль в ГПХ, так как высокая вязкость ограничивает диффузию и ухудшает разрешение, что особенно важно при анализе макромо­ лекул, которые имеют относительно низкие коэффициенты диффу­ зии. Растворитель должен быть совместим с детектором и должен позволять отличать вещество от растворителя. В настоящее время в ГПХ чаще всего используется дифференциальный рефрактометр. Поэтому в качестве растворителей широко применяются толуол, трихлорбензол и л-крезол; в этой методике они предпочтительны для многих полимеров, растворимых в органических растворите­ лях, и позволяют использовать рефрактометр. Однако они редко применяются в гель-фильтрационной хроматографии не только из-за своих свойств, но также из-за сильного поглощения в УФобласти, так как в этой методике обычно используются УФ-де- текторы.

Растворитель также должен быть совместим с материалом, из которого изготовлена система. Галогениды, обычно добавляемые в биологические материалы в качестве стабилизаторов и для кон­ троля рН водных систем, могут вызывать коррозию деталей из не­ ржавеющей стали. Поэтому надо всегда пытаться заменить галоге-

ниды на сульфаты или фосфаты. Роль солей как электролитов является важной в эксклюзионной хроматографии, так как некото­ рые молекулы изменяют размер при изменении состава раствори­ теля или концентрации электролита. Кроме того, при изменении активности электролита может меняться размер пор мягких гелей.

107 г

Отсчеты ( V R )

рис. 7.10. Размер пор твердого геля порасила не зависит от рас­ творителя, в то время как калибровочная кривая для декстрана сдвигается с изменением концентрации электролита в растворите­ ле, показывая, что молекула декстрана в воде более вытянута, чем в солевом растворе. В подписи к рисунку объясняется, чем вызван сдвиг кривых. Известно, что наблюдаемый молекулярный вес поли­ электролита при переходе от воды к 0,1 н. раствору электролита