книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

ния поправок на геометрическую конфигурацию, многие значи­ тельные работы могут быть сделаны прямой калибровкой или калибровкой с вторичными стандартами. Для более точной интер­ претации должны быть сделаны допущения на аномалии кривых,

6.Law R. D., Proceedings 4th Intern. GPC Seminar, Miami, May, 1967, p. 180, published by Waters Associates, Inc., Framingham, Mass.

7.Spell J. L . , Proceedings 4th Intern. GPC Seminar, Miami, May, 1967, p. 212, published by Waters Associates, Inc., Framingham, Mass.

10.Bombaugh K. J., Levangie R. F., Separation Sci, 5 (6) (1970).

11.Hendrikson J. G , Anal. Chem, 40, 49 (1968).

12.Snyder L . R., Saunders D. L , J. Chromatog. Sci, 7, 195 (1969).

13.Snyder L . R., J. Chromatog. Sci, 7, 352 (1969).

14.Waters J. L . , Little J. N., Horgan D. F., J. Chromatog. Sci, 7, 293 (1969).

15.Bombaugh K. /., Can R/D, 2 (5), 41 (1969).

16. Heitz W., Bomer В., Ullner H., Makromol. Chem, 121, 102—116 (1969).

17.Bombaugh K. J-, Dark W. A., Levangie R. F., Application of GPC to Aqueous Systems, in Proceedings 4th Intern. GPC Seminar, Miami, May, 1967, p. 33, published by Waters Associates, Inc., Framingham, Mass.

21.Mailer W., Nature, 207, 693 (1965).

22.Moore J. С, пат. США 3326875.

23.Sephadex in Gel Filtration, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden.

24. Pavelich W. A., Livigni R. N.. J. Polymer Sci, Part C, 215 (1967).

25.Harmon D. J., J. Appl. Polymer Sci, 11, 1333 (1967).

26.Hendrickson J. G., J. Appl. Polymer Sci, 11, 1419 (1967).

27.Porath J., Bennich H., Arch. Biochem. Biophys, 152 (1962).

28.Martin A. J. P., in «Gas Chromatography*, Coates V. J , Noebels H. J , Fageson I. S, eds. Academic Press, New York, 1958, p. 237.

29. Bombaugh K. J., Levangie R. F., J. Chromatog. Sci, 8 (10), 560—566 (1970).

30.Bombaugh K. / , J. Chromatog, 53 (1), 27—35 (1970).

31.Cazes J., J. Chem. Educ, 43, A567, A625 (1966).

32. Gribisic Z , Rempp P.. Benoit H., J. Polymer Sci, Part B-5, 753 (1967).

33. Grubisic-Gallot Z~, Benoit H., Proceedings 7th Intern. GPC Seminar, Monte

Глава 8

ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Ч. Скотт

А. Введение

Ионообменные материалы представляют важный класс непод­ вижных фаз, используемых в жидкостной хроматографии. В ионо­ обменной колонке имеет место обратимый обмен ионов между неподвижной ионообменной и внешней жидкой подвижной фазами. Различие в сродстве ионов образца и ионообменной неподвижной фазы приводит к хроматографическому разделению.

Ионообменная хроматография — одна из первых используемых хроматографических методик. Примерно с начала двадцатого века ионообменные материалы начали применяться для снижения жесткости воды и обработки ее. Сначала в этих целях использо­ вались различные природные минералы, такие, как цеолиты; позд­ нее были приготовлены и опробованы синтетические материалы.

Первые синтетические органические ионообменные смолы были разработаны в тридцатых годах [1]. Впоследствии были разрабо­ таны многочисленные синтетические смолы, а в начале сороковых годов появились сшитые полистирольные смолы, имеющие чрезвычайно важное значение. Эти смолы, которые после вто­ рой мировой войны применялись как стандартные материалы для водоподготовки, теперь играют первостепенную роль в ионообмен­ ной хроматографии.

Развитие ионообменных методов, применяемых для разделения редких земель и многочисленных продуктов расщепления [2, 3], было особенно важно в ядерной физике, а распространение этих методов в биохимии сделало возможным решение многих чрез­ вычайно сложных проблем, связанных с определением структур белков и нуклеиновых кислот [4, 5]. Препаративная ионообмен­ ная хроматография используется также для выделения промыш­ ленным способом лекарственных препаратов, биохимических, син­ тетических трансурановых соединений и т. д.

Б. Ионообменные материалы

Хотя в качестве неподвижных фаз в жидко-жидкостной хро­ матографии могут с успехом использоваться некоторые жидкости, обладающие ионообменными свойствами, чаще всего все-таки используются твердые ионообменники, и поэтому мы ограничимся только рассмотрением этой группы соединений.

1. Свойства

Идеальная ионообменная неподвижная фаза должна быть не­ растворимой и химически стабильной. Ионообменник должен иметь стабильную структуру. Желательно, чтобы составляющие его ча­ стицы имели форму шариков и были однаковыми по размеру, так как это облегчит упаковку колонки. Обменная емкость неподвиж­ ной фазы должна быть высокой, а ионообменные центры должны быть по природе монофункциональными.

Имеется много типов ионообменных материалов. Это природ­ ные минералы, например глины и цеолиты, некоторые неоргани­ ческие окислы, однако наиболее широко используемые в жидко­ стной хроматографии твердые ионообменники являются синтети­ ческими материалами, синтетическими полимерами и производ­ ными целлюлозы.

3. Ионообменные смолы

Наиболее важный в хроматографии класс ионообменных ма­ териалов составляют синтетические смолы. Эти материалы содер­ жат кислотные или основные полярные группы, вводимые до или после стадии полимеризации.

Каждая ионообменная смола состоит из нерастворимой поли­ мерной проницаемой матрицы. Эта матрица, или решетка, содер­ жит фиксированные заряженные группы и подвижные противоионы с зарядом противоположного знака. Эти противоионы могут быть заменены на другие ионы, содержащиеся во внешней жидкой фазе. Таким образом, методом ионообменной хроматографии мож­ но проводить разделение веществ, находящихся, по крайней мере частично, в ионизованной форме, однако в некоторой степени про­ является и физическая сорбция на поверхности смолы.

Ионообменные центры распределены по полимерной цепи и,

Этими группами определяются тип и активность обменника. Ионообменные смолы подразделяются на катионо- и анионообмеи-

смолы, сильно- и слабоосновные анионообменные смолы. Выше­ указанные свойства ионообменников придают им различные ак­ тивные группы. Наиболее важные сильнокислотные катионообмен­ ные смолы содержат сульфогруппы (—S03~H+ ) (см. таблицу).

Ионообменная хроматография 213

Слабокислотпые катионообменные смолы могут содержать во

ноосновной полистирольный сополимер с четвертичными аммоний­

всего используемых в жидкостной хроматографии. Типичными представителями таких ионообменников являются сшитые полистирольные смолы, в действительности они представляют собой сополимеры стирола и дивинилбензола (т. е. при полимеризации стирола дивинилбензол выступает как сшивающий агент, образуя

ионообменных смол относятся также смолы с акрильной полимер­ ной решеткой, фенольной решеткой и др.

Чтобы решить проблему массопереноса макромолекул, напри­ мер молекул белка, в матрице ионообменника, был предложен другой класс ионообменных материалов с более пористой мат­ рицей. Эти ионообменники получают, вводя ионизуемые группы внутрь полиакриламидных гелей и углеводородов, таких, как цел­ люлоза или декстран. Эти материалы имеют очень низкую плот­ ность обменных центров и матрицу гидрофильного типа. Они

обычно интенсивно набухают в воде, и обра- ( .зующаяся в результате нежесткая структура легко деформируется под действием тока жидкости. В основном эти материалы исполь­ зуются для разделения больших молекул био­ логического происхождения, и вследствие низкой плотности обменных центров такой об­

мен протекает в мягких условиях.

стенцию, подобную гелю. Макросетчатые ионообменные смолы (рис. 8.1,6) содержат не только микропоры, но и поры шириной в несколько сот ангстрем. Эти смолы имеют высокую внутреннюю площадь поверхности и относительно высокую пористость; благо­ даря жесткости пористой структуры каналы, образующиеся в центре частиц смолы, доступны для относительно больших моле­ кул, что снижает влияние массопереноса в твердой фазе.

Другим структурным типом ионообменных смол являются по­ верхностно-пленочные смолы (рис. 8.1,б), твердая сердцевина которых окружена тонкой пленкой сшитого материала. Смолы данного типа, как показано, позволяют снизить сопротивление массопереносу в твердой фазе и, следовательно, ускоряют сорбционные процессы. Однако емкость этих смол чрезвычайно низка, и в тех хроматографических системах, где используются указан­ ные материалы, можно проводить разделение только очень малень­ ких образцов.

менных смол, производимых фирмой «Dow Chemical Company*, дается числом, которое ставится как номер после названия смолы.

мер пор, проницаемость и их набухаемость в растворе очень вы­ соки. В то же время смолы со степенью сшивания больше 12% характеризуются удовлетворительной структурной прочностью, но имеют очень малый эффективный размер пор, проницаемость и набухаемость. Массоперенос внутри таких смол происходит чрез­ вычайно медленно или вообще невозможен в случае больших молекул. Чаще всего используемые смолы имеют среднюю степень

Если катионообменник содержит функциональную группу в исходной кислотной форме (например, сульфогруппу), то о нем говорят, что он находится в Н+ -форме. Когда эти протоны об­ менены на другие катионы, смола находится в солевой форме (на­ пример, NH4"- или Ыа+ -форме). Анионообменники могут нахо­ диться в исходной ОН-форме, но обычно их превращают в другие анионные формы (например, С1_ -форму). Большинство анионообменных смол получают в С1~-форме, так как она очень ста­ бильна.

Емкость смолы определяется количеством подвижных ионов, которое смола способна связывать; следовательно, емкость яв­ ляется мерой числа доступных функциональных групп в смоле. Емкость обычно выражается числом миллиэквпвалептов, прихо­ дящихся на грамм сухой смолы в Н+- или С1~-форме. Для

216 Глава 8

слабокислотных или слабоосновных анионообменников емкость заметно зависит от рН, об этом говорят кривые титрования ионообменников (рис. 8.2). Максимум емкости сильнокислотных или сильноосновных смол соответствует гораздо большему диапазону значений рН.

Хотя ионообменные смолы обычно имеют удовлетворительную химическую стойкость, температура, при которой они могут быть

предназначены для длительного использования, верхний предел температуры не должен превышать 80 С С.

В. Ионообменные равновесия

Рассмотрим, как проходит образец катионного типа через катионообменную смолу колонки в процессе хроматографирования. Фронт образца движется к первым порциям ионообменной на­ садки и когда ионы образца достигнут насадки, они будут стре­ миться обмениваться с подвижными катионами (А+ ) смолы:

ионы образца будут стремиться десорбироваться и будет наблю­ даться указанная выше обратная реакция. Заметим, что вслед­ ствие десорбции смола восстанавливается в своей первоначальной форме. При прохождении образца через ионообменную колонку происходит поочередно сорбция и десорбция. Различия в сте­ пени сорбции и скорости сорбции различных веществ и исполь­ зуются для их хроматографического разделения.

Обычно в ионообменных методах используется различное рас­ пределение ионных компонентов между внешним раствором и твердой фазой. Рассмотрим распределение ионных частиц (А) ме­ жду внешним раствором и ионообменной смолой. Обычно коэф­ фициент распределения обозначают как отношение

„число молей А в 1 г обменника число молей А в 1 мл раствора

Если коэффициент разделения меньше единицы, то на ионообменнике предпочтительно сорбируется В. Этот коэффициент разде­ ления (или другие подобные параметры) дает возможность оце­ нить разрешающую способность смолы.

Ионообменные смолы отличаются тем, что они имеют широкий диапазон значений К для различных ионных групп. В некоторых сложных смесях значение К для составляющих может меняться на несколько порядков. Такой чрезвычайно широкий диапазон зна­ чений К (и, следовательно, применимость ко многим образцам) — одно из главных достоинств ионообменных смол. Однако в ионо­ обменной хроматографии может возникнуть необходимость в гра­

В ионообменных разделениях коэффициент распределения мож­ но изменить несколькими способами. Во-первых, он зависит от концентрации конкурирующих ионов в подвижной фазе. Напри­ мер, в катионообменном процессе увеличение концентрации не­ органических катионов в подвижной фазе будет уменьшать срод­ ство органического вещества к ионообменнику и, следовательно, ускорит их прохождение через колонку.

Другой метод, используемый для изменения коэффициентов

основными смолами активные группы не будут ионизованы

соответственно при основных и кислотных рН. Так, связанное ве­ щество может быть вымыто из такой смолы при изменении рН элюента. С сильноосновными и сильнокислотными смолами этот эффект выражается не так четко. Коэффициент распределения также зависит от степени ионизации различных образцов, в свою очередь определяемой рН системы, ионной силы и т. д.

Кроме того, на коэффициент распределения влияет рабочая температура. Обычно с увеличением температуры коэффициент распределения снижается, и это позволяет ускорить пропускание образца через колонку. В некоторых случаях можно частично или полностью изменить порядок элюирования двух разрешенных об­ разцов при относительно небольших изменениях температуры.

2. Градиентное элюирование

Длительность разделения сложных смесей можно уменьшить, изменяя свойства подвижной фазы в процессе хроматографирова-

В результате на начальной стадии опыта при разделении слабо сорбируемых компонентов можно будет использовать полную раз­ делительную силу колонки, а затем быстрее десорбировать сильно

теля, в процессе разделения. Изменение состава растворителя в результате увеличения концентрации обменных ионов — вероятно, наиболее часто используемый метод. Однако в некоторых случаях для достижения высокого разрешения и быстрого разделения при­ ходится изменять во времени все эти свойства.

3. Поглощение растворителя

Когда сухую полистирольную ионообменную смолу помещают в воду, она быстро абсорбирует некоторое количество воды, обрат­ но пропорциональное степени сшивания, и увеличивается в разме­ ре, т. е. набухает. Количество абсорбированной воды и степень набухания слоя смолы могут использоваться на практике как кос­ венный метод определения степени сшивания смолы.

Максимальное количество абсорбируемой воды и соответствую­ щий объем набухшей смолы представляют определенный интерес в хроматографии, так как они определяют объем смолы при по­ гружении ее в чистую воду или сильно разбавленные растворы. Как только концентрация образца возрастает, активность воды уменьшается, и смола сжимается. Это очень важный момент, так как некоторые хроматографические разделения проводятся при ис-

время опыта. В таких случаях изменение объема смолы во время опыта может ухудшить разделение. Смолы с малым числом попе­ речных связей изменяют размеры в гораздо большей степени, по­ этому градиентное элюирование следует проводить со смолами, имеющими достаточно высокую степень сшивания (8% и выше).

Г. Хроматография с ионообменными смолами

Образец вводится в верхнюю часть ионообменной колонки. За­ грузка образца должна составлять менее 5% обменной емкости всего количества смолы. Абсорбированные ионы постепенно вместе с соответствующим элюентом движутся вниз по колонке; переме­ щение их возможно в результате последовательных процессов сорбции — десорбции. Элюент или течет через колонку под дей­ ствием силы тяжести, или его прокачивают через колонку с по­ мощью насоса или другого подходящего оборудования. Если коэф­ фициенты распределения составляющих ионов существенно раз­ личны, разделяющиеся компоненты будут покидать колонку с раз­ личной скоростью и выходить как разделенные пики. Когда изме­ ряется физическое свойство, эквивалентное концентрации раство­ ренного вещества в элюате, результирующая гистограмма будет иметь серию пиков, каждый из которых соответствует одному из растворенных веществ.

Обычно разделение различных ионов одинакового размера и заряда достигается использованием различия в обменных потен­ циалах ионов. Разделение может также зависеть от рН и ионной силы раствора образца, рабочей температуры и специфической природы ионообменника.

Кинетику обмена в жидкостной колоночной хроматографии можно описать, рассматривая различные возможные механизмы обмена растворенных веществ между подвижной и неподвижной фазами. На скорость процесса могут влиять: 1) массоперенос рас­ творенного вещества из подвижной фазы к поверхности неподвиж­ ной фазы, 2) массоперенос растворенного вещества через твердую фазу, 3) реакция или сорбция на сорбционных центрах, 4) обрат­ ный массоперенос растворенного вещества через твердую фазу и 5) массоперенос растворенного вещества с поверхности неподвиж­ ной фазы в подвижную фазу. На обменные процессы могут влиять все перечисленные стадии, но особенно важны стадии массопереноса, и обычно скорость массопереноса через твердую фазу опре­ деляет скорость всего процесса.

Много усилий было затрачено на то, чтобы получить ионооб­ менные материалы, в которых было бы снижено сопротивление