книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

10 Глава 1

исследователь может оценить приемлемость новых хроматографических методик. В этой главе будут рассмотрены теоретические основы хроматографии и показано их применение.

Классическая колоночная жидкостная хроматография — хорошо

а

I

течет через колонку под действием силы тяжести, образец соби­ рается во фракции, которые последовательно анализируются. Та­ кой метод характеризуется низкой эффективностью колонок и дли­ тельным временем разделения.

В новом методе используются колонки малого диаметра (1—Змм) и размер частиц твердого носителя не достигает 50 мкм. Иногда успешно применяются специально изготовленные частицы (поверхностно-пористые зерна). Элюент прокачивается через ко­

На рис. 1.1 показано разделение трехкомпонентной системы, осуществленное менее чем за 1 мин методом высокоскоростной жидкостной хроматографии ( ЖХ) при линейной скорости раство­ рителя 3,2 см/с. Разделение это несложное, но оно показывает, с

какой скоростью можно разделить вещества, используя метод жид­ костной хроматографии.

Газовая хроматография (ГХ) — очень мощный метод разделе­ ния летучих веществ. Однако он неприменим для веществ с моле­ кулярным весом выше примерно 300, термически нестойких и ионогенных веществ. В таких случаях преимущественно используется жидкостная хроматография. Так, именно этот метод с успехом

фия и высокоскоростная жидкостная хроматография дополняют друг друга.

Многие исследователи, начинающие работать с высокоскорост­ ной жидкостной хроматографией, имеют опыт работы с газовой хроматографией. Хотя этот опыт и может быть использован, необ­ ходимо помнить, что между этими методами имеется ряд суще­ ственных различий. Например, в ГХ межколоночными эффектами, такими, как влияние медленного ввода пробы и мертвого объема, часто пренебрегают, в то время как в ЖХ (особенно при использовании высокоэффективных колонок) этого делать нельзя. Далее будут особо отмечены основные различия между газовой

ижидкостной хроматографией.

Б.Общие вопросы хроматографии

/. Определения и описание

Хроматография — это метод разделения смесей компонентов, основанный на различии в равновесном распределении компонен­ тов образца между двумя несмешивающимися фазами. Одна из этих фаз подвижная, другая — неподвижная. Компоненты образца движутся через хроматографическую систему только тогда, когда они находятся в подвижной фазе. Линейная скорость движения является функцией равновесного распределения. Компоненты, рас­ пределяющиеся предпочтительно в стационарной фазе, движутея медленнее компонентов, распределяющихся в основном в подвиж­ ной фазе. Таким образом, разделение есть результат различия линейных скоростей движения, что в свою очередь вызвано разли­ чием в равновесном распределении.

Имеется три режима хроматографических процессов: элютивный, фронтальный и вытеснительный. В высокоскоростной жид­ костной хроматографии в настоящее время применяется только элютивный режим. Фронтальный и вытеснительный режимы во всех видах хроматографии используются реже и поэтому рассмат­ риваться здесь не будут.

В элютивном режиме компоненты образца вводятся (инъектируются) в хроматографическую систему (слой насадки) и про­ пускаются через слой насадки. Если система представляет собой колонку, компоненты вымываются из нее соответственно их рас­ пределению между стационарной и подвижной фазами. Концен­ трационное распределение чаще всего симметричное и имеет вид гауссовой функции. Симметричные пики получают в тех случаях, когда используются очень малые пробы вещества (так что изо­ терма распределения линейна). Так как при этом наблюдается наибольшая эффективность, то в высокоскоростной ЖХ используют очень маленькие образцы.

Хроматографические методы можно классифицировать в соот­ ветствии с выбранным типом подвижной и неподвижной фаз. Га­ зовая хроматография объединяет те методы, в которых подвижной фазой служит газ; жидкостная хроматография — те, в которых подвижная фаза жидкость. В зависимости от типа используемой неподвижной фазы различают следующие виды хроматографии: твердо-жидкостная (liguid— solid) (ТЖХ) и жидко-жидкостная (liquid — liquid) (ЖЖХ) . Методы жидкостной хроматографии можно также классифицировать в зависимости от используемого механизма удерживания: ионообменная, адсорбционная, распре­ делительная и эксклюзионная хроматография. Все эти механизмы хорошо изучены, исключение составляет только эксклюзионный механизм, на котором в основном базируется гель-проникающая, или гель-фильтрационная хроматография. В этом методе непо­ движной фазой является пористое твердое вещество (гель) с раз­ мером пор, соответствующим размеру молекул анализируемых ве­ ществ. Разделение происходит из-за различий в размере молекул образца. Достаточно маленькие молекулы способны проникать в поры матрицы, в то время как большие молекулы остаются в свободном объеме между частицами. Соответственно первыми вы­ мываются самые большие молекулы, следом за ними молекулы меньшего размера. Этот метод используется главным образом для фракционирования полимеров и белков; в гл. 7 метод ГПХ рас­ сматривается подробно.

И наконец, в жидкостной хроматографии используются и ко­ лонки, и открытые насадки (бумажная и тонкослойная хромато­ графия). Высокоскоростная ЖХ выполняется обычно в колоноч­ ном варианте, однако тонкопленочная хроматография в последнее время рассматривается как высокоскоростная форма тонкослой­ ной хроматографии [3].

2.Удерживание

Как мы уже отмечали ранее, если размер образца достаточно мал, при вымывании компонентов из колонки получаются сим­ метричные гауссовы пики. При таких условиях можно установить

непосредственную зависимость времени выхода максимума пика и константы равновесия (коэффициент равновесного распределения). На рис. 1.2 показано, как определяется это время, названное вре­ менем удерживания tR. Предполагается, что при прохождении че­ рез хроматографическую колонку молекулы растворенного вещества имеют равновесное распределение. Если пик симметричный, то время удерживания не зависит от количества введенного образца. В этих условиях изотерма распределения линейна (т. е. увеличе­ ние количества образца в подвижной фазе приводит к пропор­ циональному увеличению количества образца в неподвижной фазе).

Метод называется линейной элютивной хроматографией. Как уже отмечалось, это те условия, которые мы стремимся реализовать в высокоскоростной жидкостной хроматографии.

Поскольку время элюирования — функция линейной скорости подвижной фазы, то более общим параметром удерживания яв­ ляется удерживаемый объем VR. Удерживаемый объем вещества — это количество миллилитров подвижной фазы, которое необходимо пропустить через колонку для вымывания образца. Удерживаемый

рости подвижной фазы v, константой пропорциональности является площадь поперечного сечения колонки. В газовой хроматографии ввиду сжимаемости газов объемная и линейная скорости зависят от режима работы колонки. При тех давлениях, которые исполь­ зуются в высокоскоростной ЖХ, жидкости не сжимаемы, и, таким образом, объемная и линейная скорости движения в колонке оди­ наковы. Другими словами, при использовании жидкостной хрома­ тографии не нужно вводить поправку на сжимаемость. Трудно

14 Глава 1

определить давление, при котором такая поправка уже необхо­ дима, однако приблизительно можно сказать, что это где-то меж­ ду 600 и 750 атм. Это давление значительно выше обычно исполь­

если межколоночный объем незначителен (гель-проникающая хро­ матография здесь не рассматривается). Мертвый объем связан с конструкцией колонки и не оказывает непосредственного влияния на разделение. О мертвом объеме мы будем говорить подробно в разд. В, где рассматривается оптимизация процесса.

Основным уравнением, описывающим удерживание в любом

где К — константа равновесия, или коэффициент равновесного распределения (концентрация образца в неподвижной фазе/кон­ центрация образца в подвижной фазе) и Vs— объем неподвижной фазы (объем жидкости, площадь поверхности или вес адсорбента). Часто удерживание дается в виде исправленного удерживаемого объема VN-

Важным параметром удерживания в хроматографии является ко­ эффициент емкости k', определяемый как

Коэффициент емкости представляет собой отношение количества компонентов образца в двух фазах и соответственно определяет степень распределения образца при перемещении его через ко­ лонку. Решая совместно уравнения (1.1) и (1.3), получим

Отсюда видно, что когда k' = 0, удерживаемый объем равен VM- Вернемся к использованию такого параметра, как время удержи­ вания, так как оно может быть получено непосредственно из хроматограммы, если объемная скорость постоянна. Если ввести в

* Определить to можно несколькими методами. Простейший из них заклю­ чается во введении соединения, родственного подвижной фазе (например, пентан, если подвижной фазой служит гексан); детектирование осуществляется дифференциальным рефрактометром.

Полученное в результате преобразования уравнение (1.6) пока­ зывает, как связано удерживание с равновесием, длиной колонки и линейной скоростью подвижной фазы. Удваивая длину колонки, удваиваем время удерживания, в то время как удваивание линей­ ной скорости подвижной фазы уменьшает в два раза время удер­ живания*. Время удерживания зависит также (через коэффициент емкости) от относительного количества стационарной и подвижной фаз. Так, в Ж Ж Х увеличение количества стационарной фазы при­ водит к большему времени удерживания. Окончательным факто­ ром, определяющим удерживание, является константа равновес­ ного распределения К; чем выше ее значение, тем больше время удерживания. Обо всем этом следует помнить в дальнейшем, так как часто, чтобы повысить эффективность и достичь соответствую­ щего разделения, приходится увеличивать длительность анализа.

В.Основные принципы разделения

/.Разрешение

Понятие разделения в хроматографии требует в первую очередь количественного определения степени разделения. Это может быть сделано с помощью разрешения Rs- При рассмотрении хромато­ граммы двухкомпонентной системы наглядно видно, что степень перекрывания хроматографической полосы определяют две харак­ теристики— расстояние между максимумами пиков и ширина хроматографических полос. На рис. 1.3 показано влияние этих двух характеристик на разрешение. На верхней хроматограмме пики

пиков увеличено, в то время как ширина хроматографической полосы осталась без изменения. На нижней хроматограмме рас­ стояние между пиками такое же, как и на верхней, но ширина хроматографической полосы меньше. Вполне понятно, что макси­ мумы пиков должны быть хорошо разделены и хроматографические полосы должны быть узкими.

Возможно следующее измерение разрешения:

где и>1 и w2 — ширина хроматографических полос, определяемая пересечением касательных в точках перегиба симметричных пиков

с базовой линией. Графическое определение разрешения показано

* Можно было бы возразить, что не имеет смысла рассматривать разреше­ ние только для двухкомпонентной системы, если имеем дело с многокомпонент­ ной смесью (например, шестьдесят веществ). Для такой смеси только описание картины потребовало бы тысячи слов. Однако даже в этом случае рассмотрение двухкомпонентной смеси может быть оправдано, так как в смеси из шестидесяти компонентов разделение хотя бы одной пары может оказаться достаточно трудным,

равную ширину, то можно преобразовать уравнение (1.7) следую­ щим образом:

Если Rs = 1, то разделение двух пиков равно 4а (так называемое 4сг-разделение). Таким образом, если ширина каждого пика равна 2а, то перекрывание пиков составит только 2%. Для высо­

Интересно отметить влияние величины перемещения на раз­ деление максимумов и ширину хроматографических пиков. Раз­ деление максимумов пиков t%l — /д, прямо пропорционально вели­ чине перемещения. Однако уширение пика равно корню квадрат­ ному из величины перемещения, т. е. в колонке с увеличением ее длины хроматографические полосы будут быстрее разделяться, чем уширяться, поэтому, как хорошо известно, более длинные колонки дают лучшее разделение. При этом опускается тот факт, что более длинные колонки требуют большего времени удерживания; см. уравнение (1.6). Кроме того, следует заметить, что в конечном счете о разделении судят по разрешению и времени анализа.

Хотя уравнения (1.7) и (1.8) и используются для определения степени разделения, они не связаны с основными хроматографическими параметрами разрешения. Если предположить, что полосы имеют равную ширину (площадь пика), можно установить зави­ симость разрешения от трех основных хроматографических пара­ метров [4].

является наиболее важным уравнением хроматографии, и, есте­ ственно, его следует детально рассмотреть. Давайте рассмотрим каждый параметр в отдельности. Селективность а определяется из уравнения (1.10), которое

показывает, что а представляет собой отношение чистого времени удерживания двух компонентов, и его можно определить непосред­ ственно из хроматограммы. Точнее говоря, а равно отношению коэффициентов равновесного распределения или коэффициентов

емкости двух компонентов. В действительности а устанавливает отношение между разделением пиков двух соседних компонентов и является мерой термодинамического различия в их распреде­ лении.

висимости от числа теоретических тарелок в колонке. В этом слу­ чае разделение возможно при условии, что два компонента имеют некоторое различие в термодинамическом распределении. Даже при таких низких значениях а, как 1,01, используя определенные хроматографические методы, можно достигнуть разделения. Кроме того, как видно из характера функции а уравнения (1.9), неболь­ шие изменения в а могут приводить к большим изменениям в ве­

зана с различием во взаимодействии двух компонентов в подвиж­ ной и стационарной фазах. Чем лучше будут исследованы силы межмолекулярного взаимодействия, тем яснее будет понята селек­ тивность. В качестве простого примера рассмотрим разделение кетона и спирта. Если для разделения применяется Ж Ж Х и в ка­ честве неподвижной фазы используется электронодонорный рас­ творитель, то в отличие от кетона спирт будет задерживаться рас­ творителем, так как он образует водородные связи с растворите­ лем. Разделение в таком случае упрощается, и для проведения его требуется всего несколько теоретических тарелок.

Чем выше избирательность хроматографической системы, тем легче осуществляется разделение. С этой точки зрения жидкостная хроматография имеет большие преимущества перед газовой. Взаи­ модействия в газовой фазе незначительны, и, следовательно, толь­ ко неподвижная фаза может быть использована для создания тер­

подвижная фаза уже не является инертной, а может играть основ­ ную роль в процессе термодинамического распределения вслед­ ствие селективного взаимодействия в подвижной фазе. В ТЖХ подвижная фаза избирательно конкурирует с растворенной моле­ кулой за центры адсорбции адсорбента. Именно этим в основном объясняется успешное применение классической ЖХ. Хотя колонка неэффективна, значения а достаточно высоки, так что разделение может быть достигнуто. Сочетание этого преимущества высоких значений а с эффективностями и скоростями, сравнимыми с та­ ковыми в газовой хроматографии, делает высокоскоростную жид­ костную хроматографию наиболее мощным способом разделения.