Вопросы

1. В чем сущность явления люминесценции?

2. Что такое явление люминесценции согласно олределению Вавилова?

3. Источники возбуждения люминесценции.

4. Правило Стокса.

5. Какие факторы влияют на интенсивность люминесценции?

6. Что такое концентрационное тушение?

7. Что такое энергетический и квантовый выходы люминесценции? Закон Вавилова.

8. Оптическая схема и принцип измерения ва флуориметре ЭФ-ЗМА.

9. Что лежит в основе количественного определения витамина В₂ методом люминесцентного анализа?

10. Объясните, почему градуировочный график при флуоресцентном определении содержания вещества часто бывает линейным только в ограниченной области концентраций?

11. На чем основан качественный люминесцентный анализ? Привести примеры качественных определений методом люминесценции в сельском хозяйстве и в пищевых объектах. 12. Навеску ввтамина В₂ (рибофлавина) масой 10 мг растворили в мерной колбе вместимостью 250 мл. Определить титр расгвора рибофлавина.

4. Хроматография

4.1. Основные принципы и классификация хроматографических методов анализа

Хроматографический (от греческого хроматос - цвет) метод анализа был разработан профессором МГУ М.С Цветом в 1903 г. М.С.Цвет установил, что зеленый пигмент растений хлорофилл не является однородным, а состоит из нескольких веществ. Разделение пигментов проводилось в стеклянной колонке (трубке), наполненной сухим твердым адсорбентом (порошок мела или карбонат кальция). При пропускании экстракта зеленого листа через эту колонку и промывании (элюировании) петролейным эфиром было получено несколько окрашенных зон, что свидетельствовало о наличии нескольких веществ в хлорофилле.

Работы М.С.Цвета послужили фундаментом для развития всех видов хроматографии.

Хроматографические методы анализа широко применяют в различных отраслях науки и техники, в том числе в молекулярной биологии, в биохимии, при исследовании пищевых сред и т.д.

Хроматография является классическим методом разделения неорганических и органических веществ.

Хроматографический анализ используется для решения ряда задач:

- разделение и исследование сложных неорганических и органических смесей;

- выделение из сложных смесей индивидуальных веществ (белков, углеводов, витаминов, гормонов, ферментов, липидов, аминокислот, органических кислот, антибиотиков и др.)

- очистка индивидуальных веществ от примесей;

- концентрирование веществ из сильно разбавленных растворов;

- разделение изотопов, редкоземельных элементов и для решения ряда других задач;

- идентификация веществ и определение количественного состава смесей веществ.

По современным представлениям хроматография - это физико- химический метод разделения компонентов сложных смесей газов, паров, жидкостей или растворенных веществ сорбционными методами в динамических условиях.

Сущность хроматографического метода - это разделение компонентов смеси между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых является подвижной (газ или жидкость), а другая - неподвижной (твердое веществ или жидкость). Хроматографию можно определить как процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента.

Классификация хроматографических методов по агрегатному состоянию фаз

Неподвижная	Подвижная фаза
фаза	газообразная	Жидкая
твердая	Газовая твердофазная хроматография	Жидкостная твердофазная хроматография (ионообменная, осадочная)
жидкая	Газо-жидкостная распределительная хроматография	Распределительная жтдкостно-жидкостная хроматография

В основе классификации хроматографических методов лежит ряд физико-химических процессов, благодаря которым происходит разделение веществ:

1. Различная адсорбционная способность компонентов смеси - адсорбционная хроматография .

2. Различная способность компонентов смеси к ионному обмену - ионообменная хроматография.

3. Различное распределение компонентов смеси между двумя несмешивающимися фазами - распределительная хроматография.

4. Различная растворимость осадков, образуемых компонентами смеси с реагентом, нанесенным на сорбент - осадочная хроматография.

Различные методы хроматографии можно также классифицировать по агрегатному состоянию фаз, способу их относительного перемещения, аппаратурному оформлению процесса и т.д.

По способу разделения, т.е. относительного перемещения фаз, различают слсдующис виды хроматографии:

Фронтальный метод. Это простейший по методике вариант хроматографии. Он состоит в том, что через колонку с сорбентом непрерывно пропускают анализируемую смесь, например, компонентов А и В в растворителе Solv. В растворе, вытекающем из колонки, определяют концентрацию каждого компонента и строят график зависимости в координатах концентрация вещества - объем раствора, прошедшего через колонку. Эту зависимость обычно называют хромагограммой или выходной кривой (рис. 4.1).

Вследствие сорбцин вещества А и В сначала из колонки будет вытекать растворитель Solv, затем растворител и менее сорбирующийся компонент А, а затем и компонент В и, таким образом, через некоторое время состав раствора при прохождении через колонку меняться не будет. Метод используется сравнительно редко.

С

S+A+B

S+A

S

V

Рис. 4.1. Выходная кривая фронтального анализа

Проявительный (элюэнтный) метод. При работе по этому методу в колонку вводят порцию анализируемой смеси, содержащей компоненты А и В в растворителе Solv, и колонку непрерывно промывают газоносителем или растворителем Solv*. При этом компоненты анализируемой смеси разделяются на зоны: хорошо сорбирующееся вещество В занимает верхнюю часть колонки, а менее сорбирующийся компонент А будет занимать нижнюю часть (рис. 4.2). Примерная хроматограмма проявительного анализа изображена на рис. 4.3.

С

В

А

V

Рис. 4.2. Распределение веществ А и В в колонке	Рис. 4.3. Хроматограмма

В газе или растворе, вытекающем из колонки, сначала появляется компонент А, далее - чистый растворитель, а затем компонент В. Чем больше концентрация компонента, тем выше пик и больше его площадь, что составляет основу количественного хроматографического анализа. Проявительный метод дает возможность разделять сложные смеси, он наиболее часто применяется в практике.

Вытеснительный метод. В этом методе анализируемую смесь компонентов А и В в растворятеле Solv вводят в колонку с сорбентом и промывают раствором вещества Д (вытеснитель), которое сорбируется лучше, чем любой из компонентов анализируемой смеси. Существенным недостатком метода является частое наложение зон компонентов смеси, поскольку зоны не разделены зоной растворителя.

Аппаратурное оформление процесса хроматографяческого разделения варьируется в очень широких пределах - от простейших установок до сложных приборов - хроматографов. Любая установка снабжена приспособлениями для ввода пробы (дозатор), для пропускания анализируемой смеси и проявителя (колонки, капилляры, специальная хроматографическая бумага или пластинки с тонким слоем сорбента), приемника элюата или коллектора фракций и детектора (регистрирующего приспособления компонентов смеси в хромагографе).

Дозатор предназначен для точного количественного отбора пробы и введения ее в хроматографическую колонку или нанесения на бумагу. В хроматограф пробу в виде газа или жидкости вводят с помощью специальных шприцев.

В хроматографической колонке происходит разделение компонентов. Размеры хроматографическах колонок и их конструктивное оформление меняются в очень широких пределах: диаметр от 2 - 34 мм до 150 мм, высота от З см до 150 см и более. Колонки могут быть стеклянные и металлические (медные, из нержавеющей стали), цельнотянутые и разьемные.

Хроматографическая бумага различается по плотности и маркируется номером: № 1, № 2, № 3, № 4. С увеличением номера возрастает плотность бумаги и соответственно замедляется скорость хроматографирования.

Детектор предназначен для обнаружения изменений в составе газа, прошедшего через колонку. Показания детектора обычно преобразуются в электрический сигнал и передаются фиксирующему или записывающему прибору.

Известно несколько теорий хроматографического процесса. Существенное значение имеют метод теоретических тарелок и кинетическая теория.

В методе теоретических тарелок хроматографическая колонка условно делится на ряд элементарных участков – «тарелок», на каждой из них быстро устанавливается равновесие между сорбентом и компонентами разделяемой смеси (подвижной фазой). Эффективность колонки тем выше, чем меньше высота Н, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ) и чем больше число теоретических тарелок. Эта теория условна, т.к. реальный процесс протекает непрерывно.

Кинетическая теория хроматографии основное внимание уделяет кинетике процесса, связывая высоту, эквивалентную теоретической тарелке, с процессами диффузии, медленным установлением равновесия и неравномерностью процесса.