(Потенциометрические биосенсоры) ферментные электроды.
К данной группе относят специальные устройства, которые состоят из индикаторного электрода и соединенного с ним гидрофильного слоя, содержащего биокатализатор (ферменты, бактерии, грибы, ткани растений и животных и т.п.). Многие биосенсоры содержат еще и полупроницаемую мембрану. Принцип их действия основан на диффузии определяемого вещества в тонкий слой биокатализатора, в котором протекает индикаторная реакция. При этом определяемое вещество (хотя и не всегда) превращается в форму, пригодную для регистрации потенциометрического сигнала. В качестве биокатализаторов обычно используют ферменты. Можно применять также химические реакции, протекающие в клетках, липосомах или в срезе биологической ткани, прикрепленной к индикаторному электроду.
Если индикаторная реакция катализируется ферментами, то электрохимические системы называют ферментными электродами. В настоящее время понятие «Ферментный электрод» несколько расширилось, так как в него включают электрохимические системы с ферментом, закрепленным не только на чувствительном элементе ионоселективного электрода, но и на носителе, расположенном на некотором расстоянии от него или даже в растворе. В первых ферментных электродах ферменты физически удерживались на поверхности электрода или в непосредственной близости от него. Позже были предложены методы химической иммобилизации, осаждения и др
Применение ферментов для создания потенциометрических датчиков определяется их высокой селективностью. Каждый фермент катализирует только один тип реакций (групповая специфичность) или вообще только одну единственную реакцию (субстратная специфичность). Каталитическая активность фермента максимальна для определенных условий среды: значений рН, температуры, химического состава. удалось разработать новый класс биосенсоров, для которых характерна чувствительность к биологическим соединениям. В частности, в медицине нашли применение глюкозные и лактатные электроды для контроля состава крови. Многообещающее будущее имеют ферментные микроэлектроды. Трудно представить себе более надежный и изящный метод определения клеточных метаболитов.
Первый ферментный электрод, чувствительный к глюкозе, был разработан Кларком в 1962 году, который поместил между мембранами электрода глюкозоксидазу. Образующийся в результате реакции пероксид водорода определяли амперометрически. Позднее Гилболт предложил электрод потенциометрического типа для определения мочевины, реакция разложения которой до иона аммония катализируется уреазой, иммобилизованной в объеме полимера на поверхности стеклянного электрода, чувствительного к однозарядным ионам.
В настоящее время в ферментных электродах в качестве электрохимических датчиков применяют платиновые, серебряные, графитовые, различные ионоселективные и газочувствительные электроды. При контакте фермента с исследуемым веществом в приэлектронном слое происходит ферментативная реакция. Если продукт этой реакции (иногда определяемое вещество) электрохимически активен, то по изменению потенциала (или тока) электрода можно судить о количестве определяемого вещества. Классический потенциометрический ферментный электрод представляет собой комбинацию ионоселективного электрода с ферментом, который обеспечивает селективность и чувствительность определений конкретного субстрата.
Стабильность показаний ферментных электродов зависит от времени жизни ферментов. При этом ферменты могут подвергаться различным превращениям. Для продления периода их активного действия применяют так называемую иммобилизацию. Иммобилизацию регентов (а фермент – это реагент нового поколения) проводят различными способами. Разработаны самые ферментные электроды. Они различаются по характеру ферментативной реакции, по природе субстрата или фермента, по типу электрохимической реакции. При всем разнообразии протекающих на электроде процессов можно выделить следующие основные типы реакций, приводящих к изменению потенциала ферментного электрода:
реакции с образованием Н2О2;
реакции, сопровождающиеся изменением рН среды;
реакции с выделением СО2 илиNH3;
реакции с образованием NH4+, CN- или других ионов;
реакции с образованием обратимой редокс-пары, например, I2/I или хинон/гидрохинон.
В качестве электрода для определения мочевины можно использовать покрытый уреазой СО2 – электрод, чувствительный к карбонат-ионам после их превращения в диоксид углерода. Реакцию контролируют и с помощью других электродов: аммоний-селективного жидкого мембранного электрода, NH3- чувствительного электрода после превращения аммония в аммиак, карбонатного жидкого мембранного электрода и т.п.
В одной из конструкций ферментного электрода для определения глюкозы в качестве чувствительного элемента применяют стеклянный рН-электрод, регистрирующий изменение концентрации глюконовой кислоты, образующейся в результате ферментативной реакции
Предложены электроды для определения суммы некоторых аминокислот (тирозин, фенилаланин, триптофан, метионин) в крови, поскольку их содержание является важным диагностическим показателем в клинических анализах. Такие датчики представляют собой катионоселективный электрод, чувствительный к образующимся при ферментативном окислении ионам аммония, на котором иммобилизован слой L-аминокислотной оксидазы из змеиного яда. Датчики другого типа регистрируют уменьшение активности иодид-ионов на поверхности электрода в результате реакций
Еще один важный электрод – пенициллиновый, широко применяется для контроля за содержанием пенициллина в бродильных средах. Он представляет собой рН-электрод, покрытый иммобилизованной пенициллиназой, которая катализирует реакцию
Электрод характеризуется небольшим временем отклика (<30с.). Наклон градуировочного графика составляет 52 мВ в диапазоне концентраций 5*10-2 -10-4 моль/л.
Разработаны ферментные электроды на основе редокс - систем. Они отличаются от ферментных электродов с ионоселективными чувствительными элементами природой электрохимических реакций, протекающих на электроде. Если в электродах на основе ионоселективных мембран чувствительным элементом является мембрана с избирательной проницаемостью, то редокс – электроды проявляют нернстовскую зависимость потенциала от отношения концентраций окисленных и восстановленных частиц в анализируемом растворе. Наиболее хорошо изучена глюкозоксидазная редокс – электродная система. Глюкозоксидазу иммобилизуют на платине, пористом графите или золоте. При погружении такого электрода в раствор глюкозы его потенциал линейно зависит от логарифма концентрации в диапазоне 50 – 400 мг/100 мл, что представляет клинический интерес, поскольку нормальный уровень глюкозы в крови равен 90-120 мг/100 мл. Источником потенциометрического сигнала в этом случае являются реакции окисления или восстановления функциональных групп на поверхности электрода пероксидом водорода, образующимся в катализируемом глюкозоксидазой процессе окисления глюкозы.
Конструктивно потенциометрические ферментные редокс - электроды весьма просты. Однако в системах, в которых в реакцию вступает большое количество субстрата, могут возникнуть проблемы, связанные с загрязнением поверхности электрода продуктами ферментативной реакции и отсутствием механизма регенерации фермента. Величина сигнала зависит также от способа предварительной обработки поверхности электрода. Применяются также потенциометрические бактериальные электроды. В электродах данного типа обычно используются газочувствительные электроды. При этом между индикаторным электродом и мембраной помещают слой бактерий, под действием которых определяемое вещество превращается в газообразный продукт, к которому чувствителен электрод. При помощи таких электродов можно определить аргинин, глутамин, нитрат – ионы, L-гистидин. В гибридных бактериально-ферментных электродах специфическая химическая реакция осуществляется с участием бактерий и фермента одновременно.
В других электродах основным элементом конструкции является тонкий слой биологической ткани, прикрепленной к поверхности индикаторного электрода. В результате ферментативной реакции, протекающей в ткани, выделяются продукты, регистрируемые электродом. Так, в электроде для определения глутамина используется тонкий срез (~ 0,05мм) свиной печени. Индикаторным электродом в обоих случаях служит аммиачный газочувствительный электрод. Однако для таких электродов характерно медленное достижение равновесия.