Склад глюкозо-цитратно-жовткового середовища для розбавлення сперми самців сільськогосподарських тварин різних видів

Компоненти розріджувача	Для сперми
	барана	бугая	кнура	жеребця
Вода дистильована	100	100	500	100
Глюкоза медична, г	0,8	3	5,0	7
Цитрат натрію тризаміщений, г	2,8	1,4	0,5
Жовток курячого яйця, мл	20	10-12	30-40	0,8
Стрептоцид білий, г	0,2	0,12	0,2	0,12
Пеніцилін. тис.О.Д.	50-75	75-100	500	200
Стрептоміцин, тис.О.Д.	50-75	75 100	500	25

До розрідження допускається сперма бугая з рухливістю не менше 8 балів і концентрацією не менше 800 млн сперміїв в 1 мл еякуляту. Таку сперму можна розбавляти в 10-20-50 разів. Спочатку її розбав­ляють безпосередньо в спермозбирачі у співвідношенні 1:1 - 1:2 і пі­сля 5-10-хвилинної витримки розбавляють додатково до потрібного об'єму. При цьому синтетичне середовище підливають по стінці по­судини невеликими порціями з наступним нахилом змішувача в гори­зонтальне положення і обертанням його навколо осі після додавання кожної порції. Після розрідження при використанні всіх способів збе­рігання в спермодозі бугая повинно бути не менше 15 млн. сперміїв із прямолінійно-поступальним рухом, тобто рухливість повинна стано­вити 4 і більше балів.

Сперму барана розріджують лише густу, з рухливістю не менше 9 балів. Розріджують її у 2-4 рази (1:1-1:3) у спермоприймачі або сте­рильному флаконі. Після розрідження концентрація сперміїв з прямо­лінійно-поступальним рухом у спермодозі повинна становити не мен­ше 80 млн. сперміїв в 1 мл.

Сперму кнура розріджують середовищем при рухливості не мен­ше 8 балів і концентрації не менше 100 млн. сперміїв. Розрідження еякуляту проводять у 2-10 разів у стерильній колбі. Перед осіменінням свиноматок можна провести додаткове розрідження, але так, щоб в 1 мл сперми було не менше 30 млн. сперміїв, а в дозі - не менше 3 млрд. статевих клітин.

Сперму жеребця допускають до розрідження з рухливістю не мен­ше 6 балів і з концентрацією не менше 150 млн. сперміїв в 1 мл спер­ми. Її можна розбавляти в 3-4 рази (1:2; 1:3), але так, щоб кількість сперміїв у дозі становила 3 млрд. і більше.

Короткочасне зберігання сперми при температурі танення льо­ду (+2... +4 °С). Цей метод досить простий та доступний. Після розрідження і півгодинного витримування сперми при кімнатній температурі, її розфасовують у стерильні поліетиленові ампули (поліетиленові пробірки, флакони). Поліетиленові ампули запаюють, а пробірки і флакони закривають стерильними нетоксичними проб­ками і закріплюють їх гумовими кільцями. На кожній ампулі попе­редньо пишуть номер плідника і дату одержання сперми. Для по­передження температурного шоку та загибелі сперміїв охолоджен­ня сперми проводять поступово. Для цього заповнені флакони та ампули залишають при кімнатній температурі (18-20 °С) на 20-30 хвилин, після чого їх обгортають шаром вати і вкладають у поліетиленові мішечки і ставлять у кувету льодом або поміщають на полицю холодильника, де температура підтримується у межах +2... +4 °С.

Для перевезення сперми використовують харчові або спеціальні термоси з льодом. При цьому необхідно попереджати струси термосів та слідкувати, щоб мішечки зі спермою були розміщені між шматоч­ками льоду. У зимовий період при низькій температурі навколишнього середовища термоси поміщають у ватні або тканинні чохли для попередження переохолодження сперми.

Зберігання сперми при температурі +5... +20 °С. Для зберігання сперми при такій температурі в синтетичне середовище, з метою гальмування обмінних процесів у статевих клітинах, додають компоненти, які зумовлюють їх анабіоз. Найбільш ефективним для зберігання сперми бугая, є використання двоокису вуглецю (СО2), яке запропонували Н.Ван-Демарк та У.Шарм. При цьому використовують спеціальний розріджувач, який включає: води дистильованої - 1000 мл натрію двовуглекислого -21г, натрію цитрату - 23,6 г, калію хлористого — 0,4 г, глюкози - 3,0 г, стрептоциду білого - 3,0 г.

Посудину із вказаним середовищем підігрівають до 96 °С в гарячій воді до розчинення стрептоциду, потім охолоджують до 20-22 °С і насичують двооксидом вуглецю доти, поки рН розріджувача досягне рівня 6,35. Для насичення використовують балонний СО2. Після цього в розріджувач добавляють жовток курячого яйця - 11 мл, 1 млн. ОД. пеніциліну і 1 млн. ОД. стрептоміцину. Підігрівають розріджувач у теплій воді до температу­ри 30-35 °С і розріджують сперму бугая у співвідношенні 1:10 - 1:40, залежно від її концентрації.

Розріджену сперму зразу ж розфасовують у скляні ампули і запаюють їх, потім поміщають у термос і зберігають при температурі +18... +20 °С.

Для розрідження і зберігання сперми кнура при температурі +16…+20 °С протягом 3-х діб використовують синтетичні середовища ГХЦС та ГХЦ. Розріджену сперму розфасовують у скляні колби або поліетиленові флакони і зберігають у стерильному боксі-термостаті або в спеціальних термосах для зберігання і транспортування. Колби закривають не герметично (пергаментним папером), без закріплення їх гумовими кільцями. При цьому сперму потрібно обережно двічі на добу перемішувати.

Для розрідження і короткотривалого (протягом 48 год.) зберігання сперми жеребця при температурі +2... +5 °С використовують середовище ЛХЦЖ. При цьому сперму розбавляють у співвідношенні 1 : 3 при температурі 25-30 °С. Охолоджують розбавлений еякулят поступово.

Транспортують сперму в спеціальних термосах, побутових сумка-холодильниках, термосах-ящиках, у яких для теплоізоляції використо­вують паралон. Сперму можна транспортувати лише через 30 хвилин після розрідження. Допускається короткочасне (1-3 год.) поступове зниження температури до 14-15 °С або підвищення до 24 °С.

Довготривале зберігання сперми в глибокозамороженому стані (кріоконсервація). Довготривале зберігання статевих клітин можливе лише за умови повного їх анабіозу. Кріоконсервацію сперми бугаїв проводять у формі гранул, облицьованих гранул та пайєт (соломинок).

Для розрідження і заморожування сперми бугая у формі гранул застосовують лактозо-жовткове середовище з гліцерином. Розріджують сперму після її оцінки так, щоб в одній гранулі (0,2 мл) після відтавання містилось не менше 15 млн. рухливих сперміїв. Розріджену сперму (температура 31±1 °С) охолоджують поступово до кімнатної температури (+18... +20), потім до +2... +4 °С протягом 4-7 годин для адаптації, стабілізації і еквілібрації (врівноваження осмотичне активних речовин і гліцерину між сперміями і розріджувачем). Заморожування сперми проводять на охолодженій у парах рідкого азоту (температура до -160... -170 °С) фторопластовій пластині з лунками. Фасують за допомогою шприца, пінетки або спеціальної розливочної машини. Після витримування пластини розфасованою спермою в парах азоту протягом 1-2 хвилин її занурюють у рідкий азот на 2 хвилини, а потім піднімають до верхнього рівня посудини й охолодженою лопаткою збирають гранули в пластмасові охолоджені стаканчики (контейнери), які у свою чергу поміщають у марлеві торбинки, фіксують і занурюють у рідкий азот для тривалого зберігання. До вільного зовнішнього кінця нитки прикріп­люють етикетку з даними про бугая-плідника (кличка, інвентарний номер, порода), дату одержання еякуляту та кількість доз.

В спермі плідників визначають загальну мікробну забрудненість, колі-тітр і колі-індекс.

Загальна мікробна забрудненість – кількість мікробних клітин, які знаходяться в 1 мл свіжоотриманої сперми. За цим показником сперму всіх видів плідників ділять на 5 ступенів чистоти:

1. Стерильна – не містить мікробів;

2. Незначно забруднена – до 100 мікробів;

3. Слабо забруднена – до 2 тисяч мікробів;

4. Середньо забруднена - до 5 тисяч мікробів;

5. Сильно забруднена – більше 5 тисяч мікробів.

За ветеринарно - санітарними нормами до використання допускається сперма перших 4 ступенів забруднення.

Колі-тітр – це найменша ступінь розбавлення сперми, в якій знаходиться кишкова паличка. В нерозбавленій спермі він повинен бути не більше 1:10 (0,1), а в розбавленій 1:10 – негативний.

Колі-індекс– це кількість кишкових паличок в одиниці об’єму сперми, тобто величина обернено пропорційна колі- тітру (для нерозбавленої сперми – 10, для розрідженої в 1:10 – негативний).

Визначення загального мікробного забруднення, колі-тітру і колі-індексу проводиться за всіма правилами мікробіологічної техніки з використанням методу серійного розведення.

Заняття № 10-11