12.1. Застосування методів рідинної хроматографії

Методами рідинної хроматографії розділяють: молекули (адсорбційна та розподільча хроматографія); високомолекулярні речовини (ексклюзійна); біологічно активні речовини та оптичні ізомери (афінна та лігандообмінна). У цьому випадку ліганд фіксований на частинках носія, причому кожен агент специфічно зв’язує індивідуальну сполуку. Після пропускання рідини через колонку певна речовина з розчину зв’язується, відділяючись та концентруючись. Гель-хроматографія (молекулярних сит або гель-фільтрація) дає можливість розділити речовини з різною молекулярною масою та різним діаметром частинок. Цей метод використовують для відділення металоорганічних комплексних сполук з гуміновими речовинами. Різновидом рідинної хроматографії є іонообмінна.

Класично процедуру розділення проводять у вертикальній колонці, якою може бути скляна трубка довжиною 20-100 см з діаметром 0,5-5 см або стальна. Можуть бути колонки довжиною і до декількох метрів, але скручені у спіраль. Колонку заповнюють стаціонарною фазою. Визначено, що найбільш повно відбувається розділення речовин за умови співвідношення довжини заповнення колонки до внутрішнього діаметру в межах 40-100. Недопустимо, щоб матеріал колонки взаємодіяв з речовинами, що їх розділяють. У стаціонарну фазу шприцом вводять певний об’єм розчину, тоді елюент. Вони переміщаються вниз колонки неперервним потоком зі сталою швидкістю під дією сили гравітації, а іноді вакуумуванням на виході з колонки. Є спосіб розділення з висхідним напрямком руху потоку суміші, причому розділення тоді більш чітке.

Для визначення відбирають порції елюату, які містять спочатку речовину, яка слабше утримується, потім речовини, які міцніше утримуються стаціонарною фазою, і їх аналізують. Якщо треба відбирати велику кількість проб, то використовують спеціальні колектори, які автоматично відбирають певну кількість елюату: крапель, мілілітрів, масу, наприклад карусельний колектор. Сучасні хроматографи містять детектори, які реєструють різні фізико-хімічні параметри системи і дозволяють встановити проходження через детектор певної речовини. Одержують хроматограму і аналізують її якісно за параметрами утримування: часом утримування або утримуваним об’ємом, притаманним певній речовині. Кількість визначають, порівнюючи площі хроматографічних максимумів того самого інгредієнта в досліджуваній та у стандартній суміші. Якщо хроматографічні максимуми мають симетричну форму та однакову ширину, тобто ідеальні, замість площ піків можна використовувати їх висоти.

В адсорбційній рідинній хроматографії використовують адсорбенти з великою кількістю неглибоких пор. Залежно від полярності стаціонарної та рухомої фаз розрізняють, нормально-фазову (НФХ), коли сорбент полярний, а рухома фаза неполярна, та обернено-фазову (ОФХ), коли сорбент неполярний, а рухома фаза полярна.

Полярні сорбенти (алюмосилікат, силікагель) містять групи –ОН, вони добре утримують речовини з кислотними властивостями, однак чутливі до Н₂О, що веде до послаблення сорбційної здатності. Полярними сорбентами користуються для розділення середньо-полярних речовин. Часто використовують полярні сорбенти з прищепленими функціональними групами (наприклад аміногрупами), що дозволяє підвищити селективність під час розділенні.

Неполярні сорбенти (сажа, діатоміт) є селективні щодо полярних сполук. Застосовують сорбенти з прищепленими неполярними групами – органічними радикалами, які містять 3-4 атоми карбону. Спеціально застосовують сорбенти з довгими вуглеводневими ланцюгами для визначення багатьох органічних речовин. Неполярні сорбенти не поглинають воду.

Для селективного розділення речовин важливими є властивості рухомої фази. Використовують різні елюенти: неполярні (гептан, циклогексан), середньополярні (ацетон, спирти), високополярні (вода), які за полярністю утворюють такий ряд:

H₂O >С₂Н₅ОН> CH₃-CO-CH₃ >CHCl₃ >C₆H₆> CCl₄> цикло-C₆H₁₂ > С₇Н₁₆.

У НФХ зростання полярності розчинника підвищує його здатність вимивати сорбовані речовин, а у ОФХ навпаки понижує.

Часто використовують суміші розчинників, бо невелика домішка другого розчинника (особливо води) суттєво збільшує елююючу здатність рухомої фази. Великий вибір елюентів дозволяє змінювати параметри утримування і селективність.

Детекторами у методі адсорбційної хроматографії є рефрактометричний (реєструють показники заломлення світла, які для розчинника та речовини різні), спектрометричний (світлопоглинання розчину різних речовин та розчинника різні). Застосовують також потенціометричні детектори, кондуктометричні детектори, які фіксують зміну електропровідності суміші, що проходить через детектор.

Рідинна розподільча хроматографія як стаціонарну фазу має твердий носій, покритий тонкою плівкою рідини: розчинника або розчину. Іноді застосовують різні розчинники, які послідовно змінюють.

Якщо носієм є гідрофільний сорбент: силікагель чи алюмогель, то він добре утримує воду або водні розчини (кислоти, луги, буферні суміші). Якщо носій інертний (подрібнене скло, целюлоза), то стаціонарною фазою можуть бути спирти, нітросполуки та інші органічні розчинники. У ролі носія може бути гідрофобна речовина, на якій утримуються неполярні органічні розчинники (наприклад бензол). У цьому випадку рухомою фазою є полярна органічна речовина і вода.

Рухомою фазою повинен бути розчинник (розчин), який не змішується із стаціонарною рідкою фазою.

Для розділення в колонку подають досліджуваний розчин, який містить суміш речовин. Речовини з розчину переходять у стаціонарну фазу. Після того в колонку вводять рухливу фазу. Відбувається перехід речовини із стаціонарної фази у рухливу і речовини поступово вимиваються з колонки. Детектори реєструють зміну характеристик розчину: електричної провідності, оптичної густини, коефіцієнта заломлення світла, флуоресценції. Простіше відбирати порції розчину і аналізувати їх. Методами рідинної хроматографії визначають жири, вуглеводи, амінокислоти, сахари, вітаміни, органічні кислоти.

Методом розподільчої хроматографії розділяють суміш карбонових кислот, якщо стаціонарною фазою є гідрофільний носій, насичений розведеним розчином H₂SO₄, а рухомою – суміш хлороформу з бутанолом. В одержаному елюаті кислоти титрують розчином лугу.

Можна розділити також амінокислоти, спирти.

Визначення загального вмісту важких металів. У витяжці з природного об’єкта або у воді попередньо руйнують комплекси важких металів з гумусовими речовинами хімічним або термічним методом. Після цього іони важких металів зв’язують у комплекси калій дибутилдитіофосфатом. Утворюється малорозчинна неполярна сполука:

Одержану суспензію пропускають через колонку, заповнену інертним носієм, насиченим толуолом. Комплекси добре затримуються колонкою. Їх елююють толуолом. Вимірюють оптичну густину елюату.

Метод гель-хроматографії застосовують для розділення органічних речовин згідно їхніх молекулярних мас та розмірів молекул.

Розділення відбувається в колонці, у якій стаціонарною фазою є гель, а рухомою – водні або органічні елюенти. Гель має пористу структуру, потрапляючи у рідину, він набрякає. Проходячи через гель, молекули, розмір яких не перевищує розміру пор гелю, дифундують у пори і затримуються. Найміцніше утримуються ті частинки, розмір молекул яких найменший. Тому з колонки вимиваються в першу чергу ті речовини, розмір молекул яких найбільший, тобто, в порядку зменшення розміру та молекулярної маси. Метод гель-хроматографії застосовують для розділення та аналізу розчинів біологічних об’єктів.

Гелі, як нерухома фаза, є трьох основних типів. Полісахариди (крохмаль, целюлоза, кукурудзяний крохмаль – сефадекс) утворюють групу м’яких гелів. Ці гелі гідрофільні, їх застосовують при невисоких температурах (до 40С) для розділення відносно низькомолекулярних речовин з водних розчинів. Гелі з синтетичних полімерів – полівінілацетату, дивініл- та вінілбензолу, утворюють групу напівжорстких. Вони витримують підвищений тиск і дещо вищі температури. Оскільки гелі цієї групи значно менш гідрофільні, то при розділенні органічних речовин можна застосовувати органічні елюенти. Гелі, утворені з силікагелю чи пористого скла – жорсткі. Тверді гелі мають сталий розмір пор, вони витримують підвищений тиск та температуру.

У методі використовують спектрофотометричні детектори або визначають виділені речовини титриметричними методами.

Аналіз ферментаційного розчину. При переробці сільськогосподар-ської продукції застосовують ферменти, виділені з рослин, тварин, якими інтенсифікують процес переробки без підвищення температури. Сполуки, супутні до ферментів, впливають на механізм їхньої дії. Тому необхідний контроль ферментаційного розчину. Методика розділення арсеназо І та оксалатної кислоти у розчині описана в практикумі Я.І.Коренмана.

Колонку заповнюють м’яким гелем сефадексом, для набухання попередньо витриманим у воді впродовж декількох годин. У колонку вводять невеликий об’єм розчину, відкривають знизу кран. Після всмоктування розчину у верхній шар двічі вводять по 0,5 мл розчину NaCl. Арсеназо І утворює забарвлений шар, який повільно збирають у градуйований посуд. Визначають вміст арсеназо І фотометрично за власним червоним забарвленням при =540 нм. Після цього з колонки вимивають розчин оксалатної кислоти. Її вміст визначають методом перманганатометричного титрування.

Іонообмінна хроматографія використовується для розділення і визначення електролітів. Хроматографічне розділення проводять переважно з водних розчинів.

Процес іонного обміну є стехіометричний і характеризується константою іонного обміну. Для процесу обміну на катіоніті

nR-H + Меⁿ⁺  R_n-Ме + nH⁺

константа іонного обміну: .

Елюентами для хроматографічного розділення є вода або водні розчини: буферні суміші, неорганічні та органічні (цитратна, тартратна, лактатна, оксалатна) кислоти, розчин ЕДТА. Іонний обмін може відбуватися також у розчинах спиртів, безводного аміаку та ацетону. На елююючу здатність рухомої фази впливає рН, іонна сила розчину, вміст синтетичних та поверхнево-активних речовин.

Стаціонарна фаза – речовини, які здатні до іонного обміну з електролітами в розчині. Це переважно органічні синтетичні іонообмінні смоли, можуть бути також неорганічні цеоліти. Застосовують часто конденсаційні смоли (продукти конденсації фенолів, фенолсульфокислот, амінів з галогенпохідними вуглеводнів, альдегідами) та полімерні смоли (полімери стиролу, акрилової кислоти та похідних), причому сорбційна ємність останніх значно вища. Серед смол розрізняють катіонообміники, аніонообміники та амфотерні іонообмінники, що містять групи Н⁺ або Na⁺, ОН^- або Cl^-. Останні є універсальними. Іоніти проявляють властивості слабких кислот або основ і характеризуються константами дисоціації.

Катіоніт R-H⁺, який містить сульфогрупу R-SO₃^-H⁺, відноситься до сильнокислих, R-PO₄^-H⁺ середньокислий, R-COO^-H⁺– слабокислий. Може бути катіоніт і в формі R-Na⁺.

Сильноосновним є R-OH^- аніоніт R-N(CH₃)₃⁺OH^-, середньо-основним – R-NН(CH₃)₂⁺OH^-, слабоосновним – R-NН₂-(CH₃)⁺OH^-, тобто ті, які мають групи –NH₂, =NH. Аніоніт може бути у формі R-Cl^-.

Залежно від сили катіоніту чи аніоніту, їх застосовують для розділення в різних діапазонах рН: сильніші – у широкому діапазоні, слабші – у значно вужчому, причому слабокислі придатні для розділення іонів у слаболужному середовищі, слаболужні – у слабокислому. Тому для конкретного розділення підбирають відповідний іоніт.

Іоніти характеризуються своєю обмінною ємністю. Повна динамічна обмінна ємність (ПДОЄ) – число груп (ммоль), які приймають участь в іонному обміні з розрахунку на 1 г сухого очищеного іоніту. Чим більша ємність, тим більшу пробу можна ввести в колонку без „проскоку” іона.

Переважно ємність іонообмінників становить 1-10 ммоль/г. На величину ємності сильнокислотних та сильноосновних іонітів майже не впливає рН розчину, а на ємність слабких впливає, подібно як на смоли з хелатними групами. Чим більша іонна сила розчину, тим слабша фіксація іона з розчину на іоніті.

Важливою властивістю іонітів є їхня селективність.

Якщо в смолу ввести групу –CH₂-SH, то вона добре фіксує катіони важких металів з утворенням нерозчинних сульфідів.

Хелатні смоли R-ЕДТА (R – радикал цитратної кислоти) утворюють стійкі комплекси з катіонами металів.

Серед іонітів є селективні до окремих іонів, наприклад, катіоніти, що містять комплексоутворюючі групи, специфічні до окремих іонів (Pb²⁺, Hg²⁺, Fe³⁺).

При оцінюванні селективності беруть до уваги властивості іонів.

• При невисоких концентраціях і кімнатній температурі селективність зростає з підвищенням заряду іонів.

• За умов однакового заряду іона найлегше сорбуються іони з більшим радіусом.

• З підвищенням температури селективність поглинання зменшується

Виходячи з цього, існують ряди спорідненості іонів до іонітів. На катіонітах краще сорбуються катіони з більшим зарядом і більшою масою. Наприклад, катіони, які є в природній воді, за здатністю утримуватися на катіоніті утворюють такий ряд:

Al³⁺ >Pb²⁺> Sr²⁺>Ca²⁺>Cd²⁺>Cu²⁺>Zn²⁺ >Mg²⁺ >(Cs⁺> Rb⁺)> K⁺> NH₄⁺> Na⁺> Li⁺; і Cu²⁺ > Zn²⁺ > Ni²⁺> Co²⁺.

Ряд може змінюватись під дією коплексоутворювачів та інших речовин.

У випадку сильнокислотних аніонітів аніони за сорбційною здатністю утворюють такий ряд:

SO₄^2- > (ClO^-₄> SCN^-) > J^-> NO₃^-> Br^-> Cl^-> OH^-> F^-

На швидкість іонного обміну впливає температура – при її підвищенні здатність до утримування іонів на іоніті зменшується.

Хроматографічне розділення складається з декількох етапів. Перший етап – підготовка іоніту, яка полягає у насиченні катіоніту кислотою або розчином солі, аніоніту – лугом або розчином солі. Так одержують іоніт у певній формі, наприклад R-H⁺, R-Na⁺, чи R-OH^-, R-Cl^-. Після цього через підготовлений іоніт пропускають аналізований розчин, з яким відбувається обмін іонами. Потім утримувані іони видаляють з іоніту, промиваючи його відповідним розчином. Лише після цього аналізують елюат.

Якщо підібрати відповідні елюенти, то можна одні іони видалити з іоніту, а інші залишаються в ньому, тобто можна добитися селективного розділення іонів.

Відоме використання іонообмінної хроматографії для розділення та визначення низки неорганічних аніонів у водах (F^-, СІ^-, NО₂^-, NО₃^-, SО₄^2-, РО₄^3-, АsО₃^3-, АsО₄^3-) із застосуванням детектора, який вимірює електропровідність розчину. Чутливість визначення, наприклад NО₃^- і SО₄^2-, становить 100 мкг/л. Як елюент застосовують розчин 2,6-піридиндикарбонової кислоти. Помилки виникають тоді, коли концентрації іонів відрізняються дуже сильно: визначенню Cl^- заважає висока концентрація F^-; визначенню SO₄^2- – J^- i S₂O₃^2-.

Колонки повинні забезпечити розділення іонів на рівні концентрацій кожного з них 1 мг/л. При розділенні аніонів у колонці іони перетворюють елюент у сполуку з низькою електропровідністю, що використовується в детекторі, яким реєструють величину електропровідності. На визначення сильно впливають домішки твердих частинок у рідині та органічних речовин (мінеральні масла, ПАР, гумінові кислоти), тому їх необхідно перед аналізом видалити з води. Заважають катіони, які здатні зв’язувати визначувані аніони у важкорозчинні сполуки, заважають природні моно- та дикарбонові кислоти. Метод зручний для експресного автоматичного контролю якості води.

На катіоніті можна розділяти амінокислоти з розчину, одержаного при гідролізі білка. Розділення можливе, оскільки для вимивання різних амінокислот потрібна різна кількість елюента.

Використовується іонообмінна хроматографія для розділення та визначення органічних кислот. В елюаті кислоти можна визначати потенціометричним титруванням.

Методом іонообмінної хроматографії визначають загальний вміст солей у воді. Загальна кількість катіонів є еквівалентною до кількості іонів Н⁺, витиснених з катіоніту.

Через катіоніт у Н⁺-формі пропускають порцію води. Відбувається обмін катіонів Ca²⁺, Mg²⁺, Na⁺, K⁺ з води на іони Н⁺ катіоніта:

R-H⁺ + Ме⁺  R-Ме⁺ + H⁺ та 2R-H⁺ + Ме²⁺  R₂-Ме²⁺ + 2H⁺_.

Після обміну кислоту вимивають з колонки дистильованою водою. В одержаному розчині кислоту титрують розчином лугу.

Подібно визначають вміст солей у сироватці. Сир та сирна маса містять багато легкозасвоюваних солей (RCOO)₂Ca. Сироватка містить солі: хлориди, фосфати, лактати та цитрати Na, K, Ca, Mg і використовується для одержання харчових продуктів та молочного цукру. Тому під час переробки вміст цих солей повинен бути відомим. Перед визначенням сироватку відфільтровують від білка. Визначення проводять обміном катіонів з катіонітом R-H⁺ та наступним титруванням виділеної кислоти лугом.

Застосовуючи іонний обмін, визначають вміст Zn²⁺ i Cd²⁺ у стічній воді металургійних підприємств.

Воду пропускають через катіоніт R-H⁺, на якому після завершення іонного обміну затримуються обидва метали.

З катіоніта 0,5 М HCl витискають Cd²⁺, повноту видалення якого контролюють розчином сульфіду (до припинення утворення жовтого CdS).

Іони Zn²⁺ елююють 2,5 M HCl у формі [ZnCl₄]^2- та контролюють повноту вимивання лужним розчином дитизону в органічному розчиннику.

Обидва метали визначають в елюаті комплексонометричним титруванням.

Використовуючи аніоніт, визначають вміст нітрату i нітриту в розчині для консервування. Нітрат та нітрит додають до мяса при засолюванні як консервант. Вміст нітратів і нітритів у мясі контролюють, оскільки через певний час, а особливо при термічній обробці, вони відновлюються до органічних нітрозосполук, які є канцерогенними.

Розчин консерванту пропускають через аніоніт R-OH^-, з яким обмінюються іони Cl^-, NO₂^-, NO₃^- (An^-):

R-OH^- + An^-  R-An^- + OH^-_.

Після елюювання дистильованою водою в розчині титрують іони ОН^- розчином HCl за фенолфталеїном. Одночасно в елюаті визначають вміст Cl^-.

В аналізі об’єктів довкілля іонообмінна хроматографія застосовується для концентрування та розділення мікрокількостей важких металів. Іони з катіоніту вимивають розчином кислоти і одержують значно більш концентрований розчин солей. Метод іонообмінної хроматографії часто застосовують для усунення електролітів з рідини з метою подальшого аналізу; для перетворення солей у кислоти або основи.