67.Нефелометрический и турбидиметрический анализ в клинической практике. Отличие от других методов фотометрии.

Нефелометрический и турбидиметрический методы применяются для анализа суспензий, эмульсий, различных взвесей и других мутных сред. Интенсивность пучка света, проходящего через такую среду, уменьшается за счет рассеивания и поглощения света взвешенными частицами.

Нефелометрия – это метод количественного анализа вещества, который базируется на измерении интенсивности светового потока, рассеянного взвешенными частицами мутной среды.

Для проведения нефелометрии используют специальные приборы – нефелометры. Суть метода нефелометрии состоит в том, что с помощью прибора перпендикулярно световому потоку, который проходит через исследуемое вещество, наблюдают рассеивание света. При этом интенсивность пучка света, проходящего через исследуемую мутную среду, снижается за счет рассеивания и поглощения света взвешенными частицами. Иногда требуется удержать твердые частиц во взвешенном состоянии, это достигается при помощи различным веществ-стабилизаторов, самый простой из них – желатин.

При использовании нефелометрии реакция антиген (исследуемый белок) — антитело (моноспецифическая антисыворотка) протекает в жидкой фазе, а образовавшиеся в результате реакции иммунные комплексы выпадают в виде нерастворимого осадка, вызывая помутнение среды. Для повышения эффективности реакции и ее ускорения реагенты помещают в раствор коллоида (обычно полиэтиленгликоля), в присутствии которого реакция заканчивается уже через несколько минут. О количестве образовавшегося иммунного преципитата судят по мутности пробы (относительно контроля). При нефелометрическом анализе мутность раствора определяют, регистрируя количество рассеянного света при прохождении хорошо сфокусированного монохроматического луча через исследуемый раствор. Учет реакции производят после ее окончания (по конечной точке) или по мере образования осадка. Эта модификация, называемая кинетической нефелометрией, более предпочтительна. Для проведения нефелометрии в клинической практике удобно использовать автоматизированные системы, адаптированные для проведения серийных диагностических исследований, отвечающих критериям контроля качества. Анализаторы отличаются природой источника излучения (ртутная лампа, лазерный элемент, вольфрамовый источник), характером учета реакции (в конечной точке или по кинетике реакции) и другими техническими характеристиками, сказывающимися в конечном счете на чувствительности и точности измерений, а также на удобстве работы с прибором.

Турбидиметрический метод анализа - данный вид исследования мутных сред основан на измерении изменения интенсивности потока световой энергии, прошедшего через дисперсную систему. Изменение потока световой энергии вызвано как поглощением, так и его рассеянием дисперсной системой. Метод аналогичен колориметрическому методу, но в ряде случаев измерение может происходить в потоке «белого света» без применения фильтров.

С точки зрения чувствительности метода, сравнение нефелометрии и турбидиметрии оказывается в пользу нефелометрии, т. к. этот метод более чувствителен, когда небольшое количество взвешенных частиц приводит к заметному возрастанию сигнала при незначительном фоне.

К турбидиметрическим методам относятся:

определение белка с сульфосалициловой кислотой (ССК),

определение белка с трихлоруксусной кислотой (ТХУ),

определение белка с бензетоний хлоридом.

Турбидиметрические методы основаны на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием преципитирующих агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния, определяемого числом светорассеивающих частиц (нефелометрический метод анализа), либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Величина светорассеяния в преципитационных методах обнаружения белка в моче зависит от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения pH среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии.

68.Иммунологические методы диагностики. Физико-химические закономерности взаимодействия антиген-антитело. Принципы и методы иммуноферментного анализа. Получение иммунных антисывороток. Метки в иммуноанализе.

Иммунологические исследования — диагностические методы, базирующиеся на специфическом взаимодействии антигенов и антител. Широко используются для выявления возбудителей инфекционных и паразитарных заболеваний, определения гормонов, беременности, видовой принадлежности белков, опухолевых антигенов, диагностики аутоиммунных болезней, для определения групп крови и совместимости переливаемой крови. Иммунологические исследования позволяют не только идентифицировать различные вирусные, бактериальные или паразитарные заболевания, но также определять титры антител к ним, что позволяет оценивать устойчивость организма к отдельным видам инфекционных болезней и прогнозировать их развитие. С помощью иммунологических методов изучают иммунитет по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.

В основе этих методов исследований лежит реакция «антиген-антитело» с образованием иммунных комплексов, которые можно обнаружить в сыворотке крови (в пробирке) различными методами.

Антиген - это вещество, которое «узнается» организмом животного как чужеродное, и которое может запускать иммунную (защитную) реакцию. Антигенами могут быть бактерии, вирусы, грибы, паразиты, а также любые другие вещества из внешней или внутренней среды (пыльца растений, белки трансплантатов тканей и органов, поверхностные белки клеток крови при ее переливании и другие соединения). В некоторых случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов.

Антитела (иммуноглобулины — IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) - это белки, которые образуются клетками организма животного в ответ на внедрение в него антигена. Антитела образуются против не всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получившие название антигенных детерминант. Наиболее важным свойством антител является их способность специфически (то есть избирательно) связываться с антигеном. Это означает, что каждое антитело «узнает» и связывается только с одним определенным антигеном. Кроме этого возможно получение искусственным путем антител, которые будут специфически связываться с другими антителами, что широко используется для создания различных диагностических тест систем. Сыворотка крови, содержащая антитела к другим антителам называется антисывороткой.

С помощью иммунологических исследований решаются две основные задачи:

Определение антигенов. Когда неизвестным компонентом реакции является антиген. Для его обнаружения в исследуемом материале используют диагностические иммунные сыворотки крови, содержащие высокоспецифичные антитела, которые были получены от животных после их вакцинации определенными антигенами.

Определение антител. В этом случае неизвестен состав антител в сыворотке крови. Их определяют по взаимодействию с заведомо известными антигенами (диагностикумами – стандартными препаратами, используемыми в качестве антигена в иммунологических или, как их еще называют, серологических реакциях). Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител (иммуноглобулинов), специфичных к примененному антигену. При исследовании антител к инфекционным заболеваниям, например к лептоспирозу или токсоплазмозу, достоверные результаты получают при исследовании «парных» проб сывороток. Сначала анализируют кровь больного, взятую в первые дни заболевания. Затем, через 10 – 14 дней, изучают повторную пробу и на основании динамики нарастания антител ставят окончательный диагноз.

Иммунологические реакции протекают в две фазы:

Специфическое связывание антител и антигенов. Обычно эта фаза длится несколько секунд или минут.

Неспецифическое проявление реакции, характеризующееся внешними признаками образования иммунных комплексов антиген-антитело. Эта фаза может развиваться в течение нескольких минут или часов. Внешние проявления некоторых реакций зависят от свойств антигена (размеры частиц, физико-химическое состояние), класса и вида антител, а также условий проведения теста (консистенции среды, концентрации солей, рН, температуры), в том числе от методов постановки «меток» на образовавшийся иммунный комплекс.

В зависимости от механизма и учета результатов иммунологические методы исследования подразделяют на: реакции, основанные на явлении агглютинации; реакции, основанные на явлении преципитации; реакции с участием комплемента; реакции нейтрализации, реакции с использованием химических и физических методов (иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализы).

Физико-химические закономерности взаимодействия антиген-антитело:

Процесс соответствующих взаимодействий, имитирующих те, которые доминируют в биохимических процессах и относящихся к нековалентным, получил название "молекулярное узнавание". Молекулярное узнавание можно определить как процесс, включающий в себя как связывание, так и выбор молекулы - "гостя" данной молекулой -"хозяином". Просто связывание молекул не является молекулярным узнаванием. Согласно Лену , "узнавание - это связывание с целью". Данное поведение характерно для многих биохимических процессов, таких как ферментативные реакции, связывание "рецептор-субстрат", сборка белковых молекул, иммунное взаимодействие антиген-антитело, транспорт через мембрану и т.д. Одним из критериев молекулярного узнавания является то, что константа ассоциации между "хозяином" и "гостем" является значительно более высокой по сравнению с константами образования комплексов между другими молекулами, присутствующими в системе. В связи с этим особое значение приобретает исследование энергетики межмолекулярных взаимодействий биомолекул. Энергетические параметры позволяют судить о силе взаимодействия, наличии или отсутствии ассоциации между молекулами, а также выявить и описать влияние растворителя на процесс молекулярного узнавания.

Иммуноферментный анализ - наиболее надежный, экономичный и высокочувствительный метод, применяемый для количественной оценки антител и антигенов. Его отличает простота проведения реакции, возможность инструментального учета и автоматизации всех ее этапов.

Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

ИФА основан на использовании антител, конъюгированных или связанных с ферментами, в основном пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Комплексы антител с ферментами называются конъюгатами. Механизм реакции при определении антигена заключается в следующем:

На твердый носитель, которым могут быть целлюлоза, полиакриламид, декстран и различные пластмассы, сорбируют антитела к искомому веществу или инфекционному агенту. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. Затем несорбированные белки отмывают специальным раствором и в лунки добавляют исследуемый материал, например сыворотку крови, где находятся искомые антигены (вирусы или бактерии и т.д.). Антитела, закрепленные на пластиковой подложке, «подбирают» антигены, присутствующие в крови пациента, специфически с ними связываясь. Затем добавляют антитела, связанные с ферментом - конъюгаты. Оставшиеся молекулы сформируют «сэндвич», состоящий из следующих слоев: фиксированное на подложке антитело —антиген — связанное с ферментом антитело.

Чтобы обнаружить образовавшиеся иммунные комплексы, т.е. соединения меченых антител с антигенами, добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к антителам ферментом. После добавления в данную систему хромогенного субстрата последний расщепляется ферментом конъюгата, в результате чего изменяется цвет раствора в лунке.

Интенсивность окрашивания пробы исследуемого материала прямо пропорциональна содержанию в ней искомого антигена. Учет интенсивности реакции опытных и контрольных проб проводят на основании измерения оптической плотности на специальных приборах - спектрофотометрах. Чем выше оптическая плотность в данной ячейке, тем большее количество специфических антител содержится в пробе.

В случае, когда неизвестным компонентом является антитело, первая реакция происходит между искомым антителом и очищенным антигеном возбудителя, фиксированным на поверхности лунок планшета. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводят вторую реакцию, в которой в качестве антигена выступает специфически связавшееся антитело, а в качестве антител к нему — конъюгат. Это вариант непрямого иммуноферментного анализа. Например, с помощью этого вариант ИФА определяют антитела к токсоплазмозу - паразитарному заболеванию кошек, собак и человека.

В последнее время все более широкое распространение в ветеринарии получили экспресс-тесты диагностики инфекционных заболеваний. Экспресс-тесты не требуют специальной длительной подготовки проб, просты в применении, отсутствует необходимость в использовании дополнительных реагентов и оборудования, поскольку все иммунореагенты находятся в составе тест-кассеты. время исполнения анализа не более - 15-25 минут. И в то же время этот метод достаточно надежен - достоверность достигает 92-98%. Их можно применять в любом месте: в кабинете, при выезде на дом, в лаборатории. Иммунохроматографические диагностические методы являются позднейшей разработкой, отвечающей всем требованиям, и наиболее широко используемыми в мире диагностическими экспресс-методами.

От наличия возможности быстро обнаружить возбудителя инфекционного заболевания может зависеть здоровье и жизнь животного, поэтому быстрая диагностика позволит назначить адекватное лечение в минимальные сроки.

Принцип работы экспресс-тестов основан на методе иммунохроматографии (ИХА), сущность которого заключается в следующем: при нанесении исследуемого образца жидкости (сыворотка крови, смывы со слизистых) на специальную нитроцеллюлозную мембрану на которой закреплены специфически связывающиеся агенты (антитела или антигены), раствор с исследуемым биологическим материалом проходит вдоль мембраны за счет капиллярных сил. В случае присутствия в исследуемом материале тестируемого антигена или антитела происходит связывание с агентами на подложке (мембране). В результате чего на мембране появляются одна или две четко окрашенные полосы, свидетельствующие о негативном или позитивном результате теста.

Наиболее известны диагностические иммунные сыворотки (антисыворотки), с помощью которых выявляют Аг возбудителей в клиническом материале, а также проводят серологическую идентификацию микроорганизмов из выделенных культур. Для установления принадлежности микроорганизмов к конкретному виду применяют видовые антисыворотки (AT). Для распознавания Аг, общих для групп микроорганизмов одного вида, применяют групповые антисыворотки (AT). Серовароспецифичные антисыворотки позволяют различать серологические варианты (серовары) микроорганизмов в пределах одного вида.

Для получения антисывороток с титром, удовлетворительным для проведения ИФА, часто требуется 4-5-кратное повторение циклов иммунизации. Отбор крови каждый раз проводится на 7 - 9-й день после последней инъекции.

Метки в иммуноанализе:

1. Радионуклид используется при радиоиммунном анализе (РИА).

2. Ферменты, катализирующие превращение бесцветного субстрата в цветной или флюоресцирующий продукт. В данном случае исследование называют иммуноферментным анализом (ИФА), его разновидность - анализ иммуноферментно-флюоресцентный.

3. Флюоресцирующие, люминесцирующие вещества и др.

В случае РИА результат измеряют на счетчиках радиоактивности в зависимости от того, какие частицы/кванты излучает конкретная метка-радионуклид. Результаты РИА нельзя зарегистрировать без соответствующих приборов. В случае ИФА при образовании цветного продукта результат реакции определяют с помощью спектрофотометра, измеряющего оптическую плотность. При использовании в качестве метки фермента, катализирующего образование флюоресцирующего продукта, результат реакции определяют на флюориметре, измеряющем излучение в определенном диапазоне длин волн.