17.Методология и клиническое значение иммунофенотипирования клеток. Классификация лимфом. Значение лабораторных методов диагностики.

Иммунофенотипирование клеток - это определение поверхностных маркёров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Иммунофенотипирование - метод, основанный на реакции антител с антигенами и используемый для определения специфических типов клеток в образцах крови, костного мозга, лимфатических узлов или других тканей. К антителам, которые реагируют со специфическими антигенами клеток, присоединена особая флюоресцентная метка. Эту метку можно обнаружить с помощью специальных приборов – проточных цитометров или люминесцентных микроскопов. Иммунофенотипирование с использованием метода проточной цитометрии имеет преимущества перед использованием других методов за счет большей точности, скорости, возможности одновременной регистрации нескольких антигенов на одной клетке.

Разработана систематизированная номенклатура маркерных молекул; в ней группы моноклональных антител, каждая их которых специфически связывается с определенной маркерной молекулой, обозначены символом CD (Claster Designation). Поскольку набор антигенов клеточной поверхности лимфоцитов зависит не только от типа и стадии дифференцировки, но и от их функционального состояния, с помощью моноклональных антител можно не только различать разные субпопуляции клеток, но и отличать покоящиеся клетки от активированных.

При миелодиспластических синдромах выявлено увеличение числа гранулоцитов со сниженной экспрессией мембранного рецептора CD11b/CD18 по сравнению со здоровыми лицами; большое число случаев отсутствия экспрессии гранулоцитами CD64 (до 66 %), экспрессия гранулоцитами антигенов лимфоидных клеток (до 38 %), низкая экспрессия CD71 гликофорин-А-позитивными эритроидными предшественниками. У больных миелодиспластическими синдромами было обнаружено снижение экспрессии нейтрофилами антигена CD43, участвующего в регуляции их адгезии и пролиферации. Бластные клетки также экспрессировали антигены более зрелых форм нейтрофилов (CD15 и CD11b в 64 и 48 % случаев соответственно). Случаи экспрессии Т-клеточных антигенов CD2 и CD5 были единичными, в то время как CD4 и CD7 экспрессировались значительно чаще (у 47 и 34 % больных). Экспрессия бластными клетками CD19 и CD20 (В-клеточные антигены) отсутствовала, a CD10 определялась у 19 % больных. В 27 % случаев бластные клетки экспрессировали CD56 (ЕК-ассоциированный антиген).

Лимфома — группа гематологических заболеваний лимфатической ткани, характеризующихся увеличением лимфатических узлов и/или поражением различных внутренних органов, в которых происходит бесконтрольное накопление «опухолевых» лимфоцитов. Первые симптомы лимфом — увеличение размеров лимфатических узлов разных групп (шейных, подмышечных или паховых).

Для лимфом характерно наличие первичного опухолевого очага, подобно солидным опухолям. Однако лимфомы способны не только к метастазированию (как солидные опухоли), но и к диссеминации по всему организму одновременно с формированием состояния, напоминающего лимфоидный лейкоз.

Выделяют лимфому Ходжкина (лимфогранулематоз) и неходжкинские лимфомы.

Лимфома Ходжкина ( лимфогранулематоз, болезнь Ходжкина, злокачественная гранулёма) — злокачественное заболевание лимфоидной ткани, характерным признаком которого является наличие гигантских клеток Рид — Березовского — Штернберга, обнаруживаемых при микроскопическом исследовании поражённых лимфатических узлов.

Лимфогистиоцитарный вариант — примерно 15 % случаев лимфомы Ходжкина. Чаще болеют мужчины моложе 35 лет, обнаруживается в ранних стадиях и имеет хороший прогноз. Преобладают зрелые лимфоциты, клетки Рид — Березовского — Штернберга редки. Вариант низкой злокачественности.

Вариант с нодулярным склерозом — наиболее частая форма, 40—50 % всех случаев. Встречается обычно у молодых женщин, располагается часто в лимфатических узлах средостения и имеет хороший прогноз. Характеризуется фиброзными тяжами, которые делят лимфоидную ткань на «узлы». Имеет две главные черты: клетки Рид — Березовского — Штернберга и лакунарные клетки. Лакунарные клетки большие по размеру, имеют множество ядер или одно многолопастное ядро, цитоплазма их широкая, светлая, пенистая.

Смешанноклеточный вариант — примерно 30 % случаев лимфомы Ходжкина. Наиболее частый вариант в развивающихся странах, у детей, пожилых лиц. Чаще болеют мужчины, клинически соответствует II—III стадии болезни с типичной общей симптоматикой и склонностью к генерализации процесса. Микроскопическая картина отличается большим полиморфизмом со множеством клеток Рид — Березовского — Штернберга, лимфоцитов, плазмоцитов, эозинофилов, фибробластов.

Вариант с подавлением лимфоидной ткани — самый редкий, меньше 5 % случаев. Клинически соответствует IV стадии болезни. Чаще встречается у пожилых больных. Полное отсутствие лимфоцитов в биоптате, преобладают клетки Рид — Березовского — Штернберга в виде пластов или фиброзные тяжи или их сочетание.

Стадии заболевания лимфогранулематозом:

1 стадия — опухоль находится в лимфатических узлах одной области (I) или в одном органе за пределами лимфатических узлов.

2 стадия — поражение лимфатических узлов в двух и более областях по одну сторону диафрагмы (вверху, внизу) (II) или органа и лимфатических узлов по одну сторону диафрагмы (IIE).

3 стадия — поражение лимфатических узлов по обе стороны диафрагмы (III), сопровождаюшееся или нет поражением органа (IIIE), или поражение селезёнки (IIIS), или всё вместе.

4 стадия — заболевание распространяется помимо лимфатических узлов на внутренние органы: печень, почки, кишечник, костный мозг и др. с их диффузным поражением

Данные лабораторного исследования:

Показатели периферической крови не специфичны для данного заболевания. Отмечаются:

Повышение СОЭ

Лимфоцитопения

Анемия различной степени выраженности

Аутоиммунная гемолитическая анемия с положительной пробой Кумбса (редко)

Снижение Fe и TIBC

Незначительный нейтрофилёз

Тромбоцитопения

Эозинофилия, особенно у больных с кожным зудом

В диагностике лимфогранулематоза могут быть полезны два антигена.

CD15, идентифицированный как моноклональное антитело Leu M1 и относящийся к Lewis X кровяному антигену; функционирует как адгезивный рецептор, обнаруживается при всех подтипах лимфогранулематоза, кроме лимфогистиоцитарного варианта.

Антиген CD30 (Ki-1), который появляется во всех клетках Рид — Березовского — Штернберга.

Неходжкинские лимфомы (НХЛ, лимфосаркома) представляют собой гетерогенную группу злокачественных лимфопролиферативных опухолей, отличающихся друг от друга по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на лечение и прогнозу.

Первым проявлением заболевания является появление одного поражённого лимфатического узла, из которого впоследствии происходит лимфогенное и гематогенное метастазирование опухоли. Первичный опухолевый очаг может локализоваться как в лимфоузлах (нодальное поражение) так и в других органах и тканях (экстранодальное поражение). При НХЛ намного чаще вовлекаются в патологический процесс периферические лимфоузлы, чем медиастинальные. Лимфатические узлы плотные безболезненные, не спаяны с кожей и подлежащими тканями. Позднее образуют конгломераты. Увеличенные лимфоузлы могут сдавливать сосуды и рядом лежащие органы, обусловливая вторичную симптоматику (синдром верхней полой вены, динамическую кишечную непроходимость, портальную гипертензию, механическую желтуху и т. п.). Поражение кольца Вальдейера — Пирогова имеет вид бугристой опухоли бледно-розового цвета, которая может прорастать в пазухи, решётчатый лабиринт. Глоточные миндалины могут быстро увеличиваться, при двустороннем поражении смыкаться и изъязвляться. Возможно поражение других органов (молочной железы, семенников, кожи, ЦНС и др.)

18.Современные методы клинического исследования крови. Сравнительная характеристика и клиническое значение микроскопии мазка и исследования крови в гематологическом анализаторе.

Основные показатели крови:

WBC (white blood cells — белые кровяные тельца) — абсолютное содержание лейкоцитов (норма 4—9 кл/л) — форменных элементов крови — отвечающих за распознавание и обезвреживание чужеродных компонентов, иммунную защиту организма от вирусов и бактерий, устранение отмирающих клеток собственного организма.

RBC (red blood cells — красные кровяные тельца) — абсолютное содержание эритроцитов (норма 4,3—5,15 кл/л) — форменных элементов крови — содержащих гемоглобин, транспортирующих кислород и углекислый газ.

HGB (Hb, hemoglobin) — концентрация гемоглобина в цельной крови (норма 132—173 г/л). Для анализа используют цианидный комплекс или бесциандидные реактивы (как замена токсичному цианиду). Измеряется в молях или граммах на литр или децилитр.

HCT (hematocrit) — гематокрит (норма 0,39—0,49), часть (% = л/л) от общего объёма крови, приходящаяся на форменные элементы крови. Кровь на 40—45 % состоит из форменных элементов (эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов) и на 60—65 % из плазмы. Гематокрит это соотношение объёма форменных элементов к плазме крови. Считается, что гематокрит отражает соотношение объёма эритроцитов к объёму плазмы крови, так как в основном эритроциты составляют объём форменных элементов крови. Гематокрит зависит от количества RBC и значения MCV и соответствует произведению RBC*MCV.

PLT (platelets — кровяные пластинки) — абсолютное содержание тромбоцитов (норма 150—400 кл/л) — форменных элементов крови — участвующих в гемостазе.

Эритроцитарные индексы (MCV, MCH, MCHC):

MCV — средний объём эритроцита в кубических микрометрах (мкм) или фемтолитрах (фл)(норма 80—95 фл). В старых анализах указывали: микроцитоз, нормоцитоз, макроцитоз.

MCH — среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците в абсолютных единицах (норма 27—31 пг), пропорциональное отношению «гемоглобин/количество эритроцитов». Цветной показатель крови в старых анализах. ЦП=MCH*0.03

MCHC — средняя концентрация гемоглобина в эритроцитарной массе, а не в цельной крови (см. выше HGB) (норма 300—380 г/л[источник не указан 546 дней]), отражает степень насыщения эритроцита гемоглобином. Снижение MCHC наблюдается при заболеваниях с нарушением синтеза гемоглобина. Тем не менее, это наиболее стабильный гематологический показатель. Любая неточность, связанная с определением гемоглобина, гематокрита, MCV, приводит к увеличению MCHC, поэтому этот параметр используется как индикатор ошибки прибора или ошибки, допущенной при подготовке пробы к исследованию.

Тромбоцитарные индексы (MPV, PDW, PCT):

MPV (mean platelet volume) — средний объём тромбоцитов (норма 7—10 фл).

PDW — относительная ширина распределения тромбоцитов по объёму, показатель гетерогенности тромбоцитов.

PCT (platelet crit) — тромбокрит (норма 0,108—0,282), доля (%) объёма цельной крови, занимаемую тромбоцитами.

Эритроцитарные индексы:

HCT/RBC — средний объём эритроцитов.

HGB/RBC — среднее содержание гемоглобина в эритроците.

HGB/HCT — средняя концентрация гемоглобина в эритроците.

RDW — Red cell Distribution Width — «ширина распределения эритроцитов» так называемый «анизоцитоз эритроцитов» — показатель гетерогенности эритроцитов, рассчитывается как коэффициент вариации среднего объёма эритроцитов.

RDW-SD — относительная ширина распределения эритроцитов по объёму, стандартное отклонение.

RDW-CV — относительная ширина распределения эритроцитов по объёму, коэффициент вариации.

P-LCR — коэффициент больших тромбоцитов.

ESR (СОЭ) (скорость оседания эритроцитов) — неспецифический индикатор патологического состояния организма.

Гемоглобин (Hb) — это основной компонент эритроцитов, который транспортирует кислород к органам и тканям. Для анализа используют цианидный комплекс или бесциандидные реактивы (как замена токсичному цианиду). Измеряется в молях или граммах на литр или децилитр. Его определение имеет не только диагностическое, но и прогностическое значение, так как патологические состояния, приводящие к уменьшению содержания гемоглобина, ведут к кислородному голоданию тканей.

Лейкоцитарные индексы:

Относительные\абсолютные показатели каждого вида лимфоцитов, гранулоцитов, агранулоцитов.

Преимуществами автоматического анализа крови являются:

• Высокая производительность

• Небольшой объем крови

• Оценка более 20 показателей, вместо 10-12 при обычном анализе крови

• Высокая точность исследования, так как подсчету подвергаются более 10 тысяч клеток из одной пробы.

Недостатки современных гематологических анализаторов:

• Невозможна точная дифференцировка и подсчет незрелых форм гранулоцитов (промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты, палочкоядерные)

• Невозможность подсчёта бластных клеток

• При оценке лейкоцитарного ростка анализаторы не позволяют выявлять изменения ядер и цитоплазмы клеток, появления атипичных клеток (например, атипичные мононуклеары), патологическая зернистость, патологические включения и т.п.

• Анализаторы не оценивают морфологию эритроцитарного ростка (изменение формы, патологические формы, патологические включения и т.п.)

• Современный анализатор не может полностью заменить микроскоп и исследование мазка крови.

Использование современных гематологических анализаторов позволяет быстро, с высокой точностью, минимальной трудоемкостью, в сочетании с широким спектром исследуемых гематологических параметров провести качественное исследование крови, оценить состояние кроветворной системы, определить дальнейшие исследования с целью установления диагноза заболевания, оценить динамику показателей крови при лечении.

Но гематологический контроль гематологических, инфекционно-воспалительных заболеваний должен включать в себя и микроскопию мазков крови.

19.Микроскопическая оценка патологических изменений в эритроцитах, клиническое значение. Методы окраски для исследования ретикулоцитов. Цитологические характеристики ретикулоцитов, клиническое значение их исследования.

Изменения размера:

Микроцитоз — преобладание в мазках крови эритроцитов с диаметром 5,0—6,5 мкм — наблюдается при наследственном сфероцитозе, железодефицитной анемии, талассемии. Все эти клетки имеют уменьшенный объем и меньшее количество гемоглобина. В основе изменений размеров эритроцитов лежит нарушение синтеза гемоглобина.

Макроцитоз — присутствие в мазках крови эритроцитов диаметром >9,0 мкм — выявляют при макроцитарных анемиях, заболеваниях печени, дефиците витамина B12 и фолиевой кислоты, анемии беременных, злокачественных образованиях, гипотиреозе, лей козах.

Мегалоцитоз — появление в мазках крови эритроцитов диаметром 11,0—12,0 мкм, гиперхромных, без просветления в центре, овальной формы. Наличие мегалоцитов в мазках крови характерно для анемий, обусловленных дефицитом витамина В12 и фолиевой кислоты, а также для анемии при глистных инвазиях.

Анизоцитоз — присутствие в мазках крови эритроцитов, различающихся по размеру: с преобладанием эритроцитов малого диаметра (микроанизоцитоз) и большого диаметра (макроанизоцитоз). Анизоцитоз — ранний признак анемии, изолированно, без других морфологических изменений в эритроцитах развивается при легких формах анемии.

Изменения формы:

Пойкилоцитоз — изменения формы эритроцитов различной степени выраженности, которые отличаются от дисковидной. В отличие от анизоцитоза он развивается при сильно выраженных анемиях и является более неблагоприятным признаком.

Лишь немногие типы форм эритроцитов оказываются специфичными для конкретных патологий. К ним относятся микросфероциты — специфические клетки для наследственного микросфероцитоза — болезни Минковского—Шоффара; серповидные клетки — характерные для серповидно-клеточной анемии. Другие изменения формы эритроцитов — мишеневидные клетки, акантоциты, стоматоциты, эллиптоциты, дакриоциты и др., могут появляться при различных патологических состояниях.

Изменения окраски:

Среди изменений окраски эритроцитов наиболее часто встречается бледная окраска эритроцитов с более широкой неокрашенной центральной частью — гипохромия эритроцитов, которая обусловлена низким насыщением эритроцита гемоглобином. Гипохромия эритроцитов — характерный признак железодефицитных анемий, при этом гипохромия, как правило, сочетается с микроцитозом. Гипохромия возможна при отравлениях свинцом, талассемии и других наследственных повреждениях эритроцитов.

Усиленная окраска эритроцитов — гиперхромия — связана с повышенным насыщением эритроцитов гемоглобином. Она встречается значительно реже, сочетается с макро- и мегалоцитозом. Эти изменения характерны для больных с дефицитом витамина В12 и фолиевой кислоты, могут наблюдаться при анемии Аддисона—Бирмера, дифиллоботриозе, злокачественных опухолях желудка, кишечника, алкоголизме.

Изменение окраски эритроцитов в виде полихроматофилии (эритроциты сероватого цвета) обусловлено окраской кислыми и основными красителями. В норме встречаются единичные полихроматофильные эритроциты. Их количество повышается при усиленном эритропоэзе (постгеморрагические анемии, гемолитические анемии после криза).

Включения в эритроцитах:

Включения являются элементами патологической регенерации.

Кольца Кебота — остатки ядерной оболочки мегалобласта, имеют вид колечка, восьмерки, окрашиваются в красный цвет. Кольца Кебота обнаруживают при дизэритропоэзе, в частности при мегалобластных анемиях (В12 и фолиеводефицитные), талассемии, остром эритромиелозе.

Тельца Жолли — мелкие фиолетово-красные включения, встречаются по 2—3 в одном эритроците, являются остатками ядра мегалобласта. В норме тельца Жолли выявляют только в крови новорожденных. Их постоянно находят в мазках крови после спленэктомии. Тельца Жолли можно обнаружить при отравлениях гемолитическими ядами, анемиях различного генеза.

Базофильная зернистость — агрегированная базофильная субстанция в виде синих гранул, лучше выявляется при окраске метиленовым синим. Появление базофильной зернистости в эритроцитах характерно для свинцового отравления (образована агрегатами рибосом и железосодержащих митохондрий), но может встречаться при сидеро- и мегалобластной анемиях, талассемии.

Тельца Гейнца—Эрлиха — единичные или множественные включения, образованные из денатурированного гемоглобина, выявляют при окраске метиловым фиолетовым. Тельца Гейнца—Эрлиха — первый признак наступающего гемолиза, их находят при отравлениях гемолитическими ядами, анемиях, вызванных дефицитом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы.

При различных патологических состояниях в периферической крови можно выявить базофильные, полихроматофильные и оксифильные нормобласты (нормоциты). Большое количество нормобластов характерно для гемолитических анемий. Они могут появляться в мазках крови при постгеморрагических анемиях, анемии Аддисона—Бирмера (в стадии ремиссии), острых лейкозах (иногда), метастазах новообразований в костный мозг, лейкемоидных реакциях при злокачественных новообразованиях, после спленэктомии, при тяжелой сердечной недостаточности.

Ретикулоциты — клетки — предшественники эритроцитов в процессе кроветворения, составляющие около 1 % от всех циркулирующих в крови эритроцитов.

Ретикулоциты обычно крупнее, чем зрелые эритроциты. Цитоплазма ретикулоцитов содержит базофильную сеточку (ретикулум) в виде мелких зерен, отдельных нитей, клубочков и т.п., которая представляет собой агрегированные рибосомы и митохондрии.

Увеличение ретикулоцитов их в периферической крови (ретикулоцитоз) отмечается:

• при гемолитических анемиях (число ретикулоцитов может доходить до 60% и более (особенно сильно увеличиваясь при гемолитических кризах);

• при острых кровопотерях (на 3 – 5 сутки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз), в том числе, увеличение ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных язвенной болезнью желудочно-кишечного тракта, брюшным тифом);

• при малярии;

• при полицитемии;

• при лечении железом железодефицитных анемий (через несколько дней (3 - 10) после начала антианемического лечения пернициозной анемии);

• при остром недостатке кислорода;

• при метастазах опухолей в костный мозг.

Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).