55.Хроматографические методы разделения веществ, их применение в клинической диагностике.

Хроматография – процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. Разделение сложных смесей хроматографическим способом основано на различной сорбируемости компонентов смеси. В процессе хроматографирования так называемая подвижная фаза (элюент), содержащая анализируемую пробу, перемещается через неподвижную фазу. Обычно неподвижная фаза представляет собой вещество с развитой поверхностью, а подвижная – поток газа или жидкости, фильтрующейся через слой сорбента. При этом происходит многократное повторение актов сорбции – десорбции, что является характерной особенностью хроматографического процесса и обуславливает эффективность хроматографического разделения.

Классификация хроматографических методов:

В основе хроматографического разделения лежат различные механизмы, как правило,дополняющие друг друга.

По доминирующему механизму могут быть выделены следующие виды хроматографии:

1) адсорбционная (в основе лежит явление адсорбции);

2) распределительная (основана на различии коэффициентов распределения вещества между двумя несмешивающимися жидкостями);

3) ионообменная (основана на различии констант ионного обмена разделяемых ионов между раствором и ионитом);

4) ситовая (основана на различии размеров молекул; используется в основном для разделения белков и других высокомолекулярных соединений на фракции);

5) хемосорбционная; в зависимости от типа химической реакции выделяют: а) осадочную; б) редокс-хроматографию;в) лигандообменную (аффинную); г) биоспецифическую.

По цели проведения различают следующие виды хроматографии:

- аналитическая хроматография используется для качественного и количественного анализа смеси веществ;

- препаративная хроматография предназначена для выделения из смеси чистых компонентов или для вещества от примесей.

По характеру подвижной и неподвижной фаз основные разновидности хроматографии: газо-жидкостная, газо-адсорбционная, жидкостно-жидкостная, жидкостно-адсорбционная, ионообменная, гель-фильтрация.

По технике эксперимента хроматография может быть колоночной (разновидность – капиллярная хроматография) и плоскостной (тонкослойной и бумажной).

Газовую хроматографию применяют для разделения летучих термически устойчивых веществ с молекулярной массой до 500. Она имеет огромное значение как для качественного, так и количественного анализа и благодаря высокой чувствительности позволяет обнаруживать микрограммовые количества соединений (до 10^{-6 г).} Колоночная хроматография широко используется для количественного разделения смесей.

Клиническое применение хроматографии:

Хроматография на бумаге и ТСХ используют для определения аминокислот, углеводов, нуклеотидов, кетокислот, гормонов и др. в биологических жидкостях (сыворотка крови, моча, слюна, пот) или в экстрактах из тканей в норме и при различных патологических состояниях. Методом хроматографии на бумаге установлены состав и содержание свободных аминокислот в плазме крови и в моче здоровых людей и при некоторых заболеваниях с нарушением азотистого обмена, например при болезнях печени, почек, болезни Вильсона (гепато-церебральная дистрофия), синдроме Фанкони (цистиноз), недостаточности витаминов, фенилкетонурии и других психических заболеваниях, вызванных токсическим действием отдельных аминокислот или продуктов их неправильного обмена на ЦНС В нормальной моче человека на двухмерной бумажной хроматограмме могут быть обнаружены глютаминовая кислота (или глютамин), аланин, глицин, таурин, β-аминоизомасляная кислота (β-АИМК), гистидин или метилгистидин.

ТСХ на окиси алюминия и силикагеле используют для качественного и количественного определения гормонов коры надпочечника (17-кетостероидов) и половых гормонов — андростерона и эстрогенов — в плазме крови и моче; этот метод применяют для ранней диагностики беременности и при гормональных заболеваниях. Сочетание электрофореза и хроматографии на бумаге впервые позволило установить различие в аминокислотном составе нормального гемоглобина человека (гемоглобин А) и гемоглобина больных серповидноклеточной анемией (гемоглобин S), положив начало изучению болезненных процессов, совершающихся на молекулярном уровне (при которых клиническое состояние больного обусловлено присутствием химически измененной белковой молекулы).