Механизм полимеразной цепной реакции

ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ПЦР

Праймеры

Праймеры – искусственно синтезированные короткие, длиной 20–30 оснований, одноцепочечные ДНК (дезоксиолигонуклеотиды), комп­ле­мен­тар­ные 3’-концам цепей искомой ДНК-матрицы. В геноме искомого организма выбирается консервативная (редко подвергающаяся генетическим перестройкам), строго специфическая нуклеотидная последовательность. К ней синтезируются специфические праймеры. Таким образом, фрагмент молекулы, который будет фланкировать (ограничивать) праймер, должен присутствовать только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене человека и отсутствовать в ДНК других возбудителей болезней или других генах человека. Правильно подобранные праймеры играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации и обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Полимераза

Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов. Для определения РНК-содержащих вирусов используется фермент обратная транскриптаза, который по РНК-матрице синтезирует ДНК-копию, которая затем участвует в ПЦР.

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

Строительный материал для синтеза комплементарных цепей (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ).

Ионы двухвалентных металлов

Ионы Mg2+ являются необходимым кофактором для ДНК-полимеразы.

Буферы

В стандартной ПЦР используются солевые буферы на основе 10–70 мМ “Трис-HCl” при рН 8–9 (20 ^oC). В буфер добавляются активаторы ПЦР – соли хлорида калия или сульфат аммония и стабилизаторы ДНК-полимераза – бычий сывороточный альбумин или желатин, а также неионные детергенты “Triton X100”, “Nonidet NP40” и “Tween 20”.

Анализируемый образец

Образец может быть подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК. Например, ДНК микроорганизмов, служащая мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

Циклический температурный режим

Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов (рис. 1).

Рис. 1. Этапы ПЦР-анализа.

1. Денатурация. Расплавление спирали ДНК и расхождение нитей. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94–96 °C на 0,5–2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2. Отжиг. Присоединение праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают. При понижении температуры одноцепочечная ДНК стремится восстановить двухцепочечное состояние и, если в реакционной смеси есть мишень (искомая ДНК), то праймеры гибридизуются с мишенью. ДНК-праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно увеличен или амплифицирован. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50–65 °С. Время отжига 20–60 сек.

3. Элонгация. Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом Тaq-полимеразой и проходит при температуре 70–72 °С. Время протекания синтеза 20–40 сек.

В ПЦР эти процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одного этапа реакции к другому достигается изменением температуры инкубационной смеси. При нагревании раствора до 93–95 ^оС происходит денатурация ДНК. Для перехода к следующему этапу – присоединению или “отжигу” праймеров – инкубационную смесь охлаждают до 50–65 ^оС. Далее смесь нагревают до 70–72 ^оС – оптимум работы Тaq-ДНК-полимеразы. На этом этапе происходит достраивание новой нити ДНК. Далее цикл повторяется снова. Многократное, или циклическое, повторение этой процедуры позволяет наработать значительное количество копий участка ДНК (ампликона).

СТАДИИ ПОСТАНОВКИ ПЦР

ПЦР-диагностика состоит из трех основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая сводится к выделению ДНК или РНК, проведению ПЦР (амплификации) и детекции продукта ПЦР. Для РНК-содержащих вирусов дополнительно проводят реакцию обратной транскрипции (получение кДНК, являющейся комплементарной вирусной РНК-матрице).