Гемоглобин

Практически весь объём эритроцита заполняет дыхательный белок — гемоглобин (Hb). Молекула Hb — тетрамер, состоящий из 4 субъединиц — полипептидных цепей глобина (2 цепи  и 2 цепей , , , , ,  в разных комбинациях), каждая из которых ковалентно связана с одной молекулой гема. Гем построен из 4 молекул пиррола, образующих порфириновое кольцо, в центре которого находится атом железа (Fe²⁺). Основная функция Hb — перенос O₂. Существует несколько типов Hb, образующихся на разных сроках развития организма, различающихся строением глобиновых цепей и сродством к кислороду. Эмбриональные Hb (‑ и ‑цепи) появляются у 19‑дневного эмбриона, присутствуют в эритроидных клетках в первые 3–6 мес беременности. Фетальный Hb (HbF — ₂₂) появляется на 8–36 нед беременности и составляет 90–95% всего Hb плода. После рождения его количество постепенно снижается и к 8 мес составляет 1%. Дефинитивные Hb — основные Hb эритроцитов взрослого человека (96–98% — HbA (A₁,) — ₂₂, 1,5–3% — HbA₂ — ₂₂). Известно более 1000 мутаций разных глобинов, значительно изменяющих свойства Hb, в первую очередь — способность транспортировать O₂.

 HbH — гомотетрамер, образующийся при ингибировании синтеза ‑цепи. Транспорт O₂. не эффективен, развивается синдром, схожий с талассемией (у гетерозигот по двум генам ‑талассемии).

 HbM — группа аномальных Hb, у которых замещение одной аминокислоты способствует образованию MetHb (хотя активность метгемоглобинредуктазы нормальна), гетерозиготы имеют врождённую метгемоглобинемию, гомозиготы погибают в ходе внутриутробного развития.

 HbS — аномальный Hb (мутация в 6‑м положении ‑цепи), у гетерозигот имеются серповидно-клеточные эритроциты (HbS от 20 до 45%, остальное — HbA, анемии нет), у гомозигот развивается серповидно-клеточная анемия (HbS — 75‑100%, остальное — HbF или HbA₂).

 Барта Hb [Bart — фамилия пациента, у которого впервые обнаружен этот Hb] — гомотетрамер, встречающийся у раннего эмбриона и при ‑талассемии, не эффективен как переносчик O₂.

 HbF — основной Hb эритроцитов плода, имеет большее сродство к O₂, чем дефинитивные Hb. Увеличение содержания HbF наблюдают при некоторых гемоглобинопатиях, гипопластических и витамин B₁₂‑дефицитной анемиях, остром лейкозе, у постоянно находящихся в условиях высокогорья.

Определение гемоглобина. В настоящее время в качестве унифицированного признан цианметгемоглобиновый (гемиглобинцианидный) метод определения Hb крови. Данный метод основан на том, что после взаимодействия с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) Hb окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), который под влиянием CN-ионов образует окрашенный в красный цвет комплекс — цианметгемоглобин (гемиглобинцианид). Концентрацию цианметгемоглобина измеряют на фотоэлектрокалориметре и расчёт концентрации Hb производят по калибровочному графику.

Ранее был широко распространён метод определения Hb с помощью гемометра Сали, представляющего собой небольшой штатив, в гнездах которого расположены градуированная пробирка и две запаянные пробирки со стандартным окрашенным раствором. Градуированной пипеткой насасывают выступающую из прокола кожи кровь до отметки 0,02 (20 мкл) и осторожно выдувают в градуированную пробирку гемометра с 0,1 н раствором соляной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой и вставляют пробирку в гнездо гемометра между пробирками со стандартным раствором. В пробирку с испытуемым раствором добавляют дистиллированную воду по каплям до тех пор, пока цвет испытуемого и стандартного растворов не совпадёт. По шкале пробирки определяют уровень жидкости, который соответствует концентрации Hb.

Формы гемоглобина. В эритроцитах Hb находится в восстановленной (HbH) и/или окисленной (HbO₂) формах, а также в виде гликозилированного Hb. В ряде случае возможно присутствие карбоксигемоглобина и метгемоглобина.

 Оксигемоглобин. В лёгких при повышенном pO₂ Hb связывает (ассоциирует) O₂, образуя оксигемоглобин (HbO₂), в этой форме HbO₂ переносит O₂ от лёгких к тканям, где O₂ легко освобождается (диссоциирует), а HbO₂ становится дезоксигенированным Hb (обозначают как HbH). Для ассоциации и диссоциации O₂ необходимо, чтобы атом железа гема был в восстановленном состоянии (Fe²⁺). При включении в гем трёхвалентного железа (Fe³⁺) образуется метгемоглобин — очень плохой переносчик O₂.

 Метгемоглобин (MetHb) — Hb, содержащий Fe гема в трёхвалентной форме (Fe³⁺); не переносит О₂; прочно связывает O₂, так что диссоциация последнего затруднена. Это приводит к метгемоглобинемии и неизбежным нарушениям газообмена. Образование MetHb может быть наследственным или приобретённым. В последнем случае это результат воздействия на эритроциты сильных окислителей. К ним относят нитраты и неорганические нитриты, сульфаниламиды и местные анестетики (например, лидокаин).

 Карбоксигемоглобин — плохой переносчик кислорода. Hb легче (примерно в 200 раз), чем с O₂, связывается с монооксидом углерода СО (угарный газ), образуя карбоксигемоглобин (O₂ замещён CO).

 Гликозилированный Hb (HbА_1с) — HbА (A₁), модифицированный ковалентным присоединением к нему глюкозы (норма HbA_1C 5,8–6,2%). К одним из первых признаков сахарного диабета относят увеличение в 2–3 раза количества HbA_1C. Этот Hb имеет худшее сродство к кислороду, чем обычный Hb.

Транспорт кислорода. Кровь ежедневно переносит из лёгких в ткани около 600 л О₂. Основной объём О₂ транспортирует HbO₂ (O₂ обратимо ассоциирован с Fe²⁺ гема, это так называемый химически связанный O₂ [неверный по существу, но — к сожалению — устоявшийся термин]). Незначительная часть O₂ растворена в крови (физически растворённый O₂). Содержание O₂ в крови в зависимости от парциального давления O₂ (Po₂) представлено на рис. 24–10.

Рис. 24–10. Содержание кислорода в крови [23]. А — ассоциированный с Hb O₂. Б — физически растворённый в крови O₂. Обратите внимание, что кривая А (в отличие от кривой Б) не имеет линейного характера, это так называемая S-образная (сигмовидная) кривая; такая форма кривой отражает то обстоятельство, что 4 субъединицы Hb связываются с O₂ кооперативно. Это обстоятельство имеет важное физиологическое значение: при конкретных и разных (!) значениях Po₂ в артериальной и в смешанной (венозной) создаются наиболее благоприятные условия для ассоциации Hb и O₂ в капиллярах лёгкого и для диссоциации Hb и O₂ в тканевых капиллярах. В то же время в плазме крови физически растворена только небольшая часть О₂ (максимально 6%); физическую растворимость О₂ описывает закон Генри (уравнение 24–6): с увеличением Po₂ содержание О₂ линейно возрастает.

Физическая растворимость газов может быть описана законом Генри (уравнение 24–6).

Уравнение 24–6

С_х = _хР_х

где: C_x — концентрация газа; _х — коэффициент растворимости газа P_x — парциальное давление газа.

Кооперативность связывания О₂ и Hb показана на рис. 24–11.

Рис. 24–11. Кривые диссоциации кислорода для миоглобина и гемоглобина в зависимости от парциального давления кислорода [9].

Из графика видно, что кривые диссоциации О₂ для миоглобина и гемоглобина различны.

 Кривая диссоциации О₂ для миоглобина имеет вид простой гиперболы — очевидное указание на то, что на обратимое связывание мономерного (не складывающегося — в отличие от Hb — из субъединиц) миоглобина мышечной ткани и О₂ влияет только Po₂. Миоглобин имеет очень высокое сродство к О_2.. Даже при Po₂, равном 1–2 мм рт.ст., миоглобин остаётся связанным с О₂ на 50%. Миоглобин связывает О_2., который в капиллярах скелетных мышц высвобождает Hb, но и сам миоглобин может освобождать О₂ в ответ на возрастание потребностей в нём мышечной ткани и при интенсивном использовании О₂ в результате физической нагрузки.

 Кривая диссоциации О₂ для гемоглобина имеет сигмоидную форму (S-образную). Это указывает на то, что субъединицы Hb работают кооперативно: чем больше О₂ связывают (отдают) субъединицы, тем легче идёт ассоциация (диссоциация) последующих молекул О₂. Из графика на рис. 24–11 также видно, что Hb (в отличие от миоглобина) имеет значительно более низкое сродство к О₂; полунасыщение гемоглобина О₂ наступает при более высоком давлении О₂ (около 26 мм рт.ст.). В капиллярах покоящихся мышц, где давление О₂ составляет около 40 мм рт.ст., большая часть кислорода возвращается в составе оксигемоглобина обратно в лёгкие. При физической работе Po₂ в мышечных капиллярах падает до 10–20 мм рт.ст. Именно в этой области (от 10 до 40 мм рт.ст.) располагается «крутая часть» S-образной кривой, где в наибольшей степени проявляется свойство кооперативной работы субъединиц.

 Физически растворённый в крови газ. Согласно закону Генри, количество растворённого в крови O₂ (любого газа) пропорционально Po₂ (парциальному давлению любого газа) и коэффициенту растворимости конкретного газа. Физическая растворимость O₂ в крови примерно в 20 раз меньше, чем растворимость СО₂, но для обоих газов незначительна. В то же время физически растворённый в крови газ — необходимый этап транспорта любого газа (например, при перемещении O₂ в эритроцит из полости альвеол).

 Кислородная ёмкость крови — максимальное возможное количество связанного с Hb О₂ — теоретически составляет 0,062 ммоль О₂ (1,39 мл О₂) на 1 г Hb (реальное значение несколько меньше — 1,34 мл О₂ на 1 г Hb). Измеренные же значения составляют для мужчин 9,4 ммоль/л (210 мл О₂/л), для женщин — 8,7 ммоль/л (195 мл О₂/л).

 Насыщение (сатурация, S) Hb О₂ (So₂) зависит от парциального давления кислорода (Po₂) и фактически отражает содержание оксигенированного Hb (HbО₂, см. кривую А на рис. 24–10, рис. 24–11). So₂ может принимать значения от 0 (HbО₂ нет) до 1 (нет HbH). При половинном насыщении (S_0,5) Po₂ равно 3,6 кПа (27 мм рт.ст.), при S_0,75 — 5,4 кПа, при S_0,98 13,3 кПа. Другими словами (см. кривую А на рис. 24–10) зависимость между So₂ и Po₂ не является линейной (характерная S-образная кривая), что благоприятствует как связыванию О₂ в лёгких (артериальная кровь) и транспорту О₂, так и освобождению О₂ в кровеносных капиллярах органов и тканей, так как насыщение артериальной крови кислородом (S_Ao₂) составляет примерно 97,5%, а венозной крови (S_Vo₂) — 75%.

 Характер насыщения (см. кривая А на рис. 24–10, рис. 24–11, рис. 24–12) таков, что кривая существенно уплощается при Po₂ около 70 мм рт.ст. Так, при Po₂ ниже 60 рт.ст. кислород хорошо связывается с Hb, но уже при Po₂ 60 мм рт.ст. насыщение составляет 90%, и дальнейшее увеличение Po₂ относительно слабо сказывается на насыщении (увеличение Po₂ от 60 до 100 мм рт.ст. увеличивает насыщение всего на 7%). Другими словами, в этом диапазоне Po₂ насыщение O₂ благоприятно для обеспечения его транспорта. Совершенно иная картина складывается при значениях Po₂ ниже 60 мм рт.ст., т.е. при небольших изменениях Po₂ из Hb освобождается существенные количества O₂, что облегчает его диффузию из крови в ткани.

 Насыщение O₂ описывает уравнение 24–7:

Уравнение 24–7

So₂ = [HbО₂]/([HbH] + [HbО₂])

где: HbО₂ — оксигенированный Hb, HbH — дезоксигенированный Hb.

Аффинитет Hb к О₂, т.е. насыщение Hb О₂ при конкретном Po₂ изменяет ряд факторов (температура, pH и Pco₂, 2,3-бифосфоглицерат; рис. 24–12).

Рис. 24–12. Диссоциация оксигемоглобина в крови в зависимости от Po₂ [4]. В зависимости от изменений (указаны стрелками) температуры, pH, Pco₂ крови и концентрации 2,3-бифосфоглицерата в эритроцитах кривая насыщения гемоглобина O₂ сдвигается вправо (что означает меньшее насыщение кислородом) или влево (что означает большее насыщение кислородом). На кривой кружочком отмечена позиция, соответствующая половинному насыщению (S_0,5).

 pH, Pco₂ и эффект Бора. Особенно существенно влияние pH: уменьшение водородного показателя (сдвиг в кислую сторону — в зону ацидоза) сдвигает кривую диссоциации Hb вправо (что способствует диссоциации О₂), тогда как увеличение pH (сдвиг в щелочную сторону — в зону алкалоза) сдвигает кривую диссоциации Hb влево (что увеличивает аффинитет О₂). Эффекты же Pco₂ на кривую диссоциации оксигемоглобина реализуются преимущественно через изменение значений водородного показателя: при поступлении CO₂ в кровь происходит уменьшение pH, что способствует диссоциации О₂ и его диффузии из крови в ткани. Напротив, в лёгких CO₂ диффундирует из крови в альвеолы, что приводит к увеличению pH, т.е. способствует связыванию О₂ с Hb. Этот влияние CO₂ и H⁺ на аффинитет О₂ к Hb известно как эффект Кристиана Бора (отец великого физика Нильса Бора). Таким образом, эффект Бора обусловлен преимущественно изменением pH при увеличении содержания CO₂ и лишь частично — связыванием CO₂ с Hb (см. далее). Физиологическое следствие эффекта Бора — облегчение диффузии O₂ из крови в ткани и связывание O₂ артериальной кровью в лёгких.

 Температура. Значение влияния температуры на аффинитет Hb к О₂ у гомойотермных животных теоретически отсутствует, но может оказаться важным при ряде ситуаций. Так, при интенсивной мышечной нагрузке температура тела увеличивается, что приводит к сдвигу кривой диссоциации вправо (увеличивается поступление О₂ в ткани). При понижении температуры (особенно пальцев, губ, ушной раковины) кривая диссоциации сдвигается влево, т.е. увеличивается аффинитет О₂; следовательно, увеличения поступления О₂, в ткани не происходит.

 2,3-Бифосфоглицерат (БФГ) — промежуточный продукт гликолиза — содержится в эритроцитах примерно в той же молярной концентрации, что и Hb. БФГ связывается с Hb (в основном за счёт взаимодействия с ‑субъединицей, т.е. с дефинитивными Hb, но не с фетальным Hb, в составе которого нет ‑субъединицы). Связывание БФГ с Hb сдвигает кривую диссоциации Hb вправо (см. рис. 24–12), что способствует диссоциации О₂ при умеренных значениях Po₂ (например, в тканевых капиллярах), но практически не влияет на кривую диссоциации при высоких значениях Po₂ (в капиллярах лёгкого). Существенно, что при усилении гликолиза (анаэробного окисления) концентрация БФГ в эритроцитах увеличивается, что является механизмом приспособления организма к гипоксии, наблюдающейся при заболеваниях лёгких, анемиях, подъёме на высоту. Так, в период адаптации к высокогорью (более 4 км над уровнем моря) концентрация БФГ уже через 2 дня возрастает почти в 2 раза (от 4,5 до 7,0 мМ). Понятно, что это снижает сродство Hb к О₂ и увеличивает количество О₂, освобождаемого из капилляров в ткани.

Транспорт CO₂. Как и О₂, СО₂ транспортируется кровью как в физически растворённом состоянии, так и в химически связанном (в составе бикарбонатов и в соединении с белками, т.е. в форме карбаматов и в том числе в связи с Hb — карбгемоглобин). Во всех 3-х состояниях (растворённое, бикарбонат, карбаматы) СО₂ присутствует и в эритроцитах (89%), и в плазме крови (11%) (табл. 24–5). При химическом связывании СО₂ образуется значительное количество протонов (H⁺).

Таблица 24–5. Содержание в крови СО₂ (мл/л)

	Артериальная	Смешанная (венозная)	Артерио-венозная разница
В растворе	25	29	4
В связи с белками	24	38	14
В форме бикарбоната	433	455	22
ВСЕГО	482	522	40

Примечание. Pсо₂ (мм рт.ст.) артериальной крови — 40, венозной — 46, артерио–венозная разница — 6.

Общее содержание CO₂ и артерио–венозная разница по CO₂. Когда артериальная кровь поступает в тканевые капилляры, она связывает дополнительно 40 мл/л CO₂ (артерио–венозная разница по CO₂, или дополнительный CO₂). Это дополнительное количество CO₂ транспортируется к лёгким в растворённом виде, как бикарбонат и в составе карбаматов. Однако, при измерении в крови содержания бикарбоната методом Ван Слайка учитывается не только бикарбонат, но также растворённый CO₂, CO₂ в составе карбаматов, угольной кислоты и карбонатов. Именно по этой причине во многих источниках существенно завышена роль бикарбоната как главного транспортёра CO₂ и занижена роль растворённого CO₂ и карбаматов (здесь и далее все значения даны в откорректированном виде, учитывающем недостатки метода Ван Слайка).

Примерно 2/3 СО₂ (68%, в том числе 63% в эритроцитах) транспортируется кровью в виде бикарбоната (НСО₃^–). Пятую часть СО₂ (22%, в том числе в виде карбгемоглобина — 21%) переносят карбаматы (СО₂ обратимо присоединён к неионизированным концевым -аминогруппам белков, образуя группировку R-NH-CОО^–). 10% СО₂ находится в растворённом состоянии (поровну в плазме и в эритроцитах). Крайне существенно то обстоятельство, что в реакциях химического связывания СО₂ образуются ионы Н⁺:

СО₂ + Н₂О  Н₂СО₃  Н⁺ + НСО₃^– R-NH₂ + СО₂  R-NH-CОО^– + Н⁺

Из обоих равновесных реакций следует, что химическое связывание СО₂ идёт с образованием ионов Н⁺. Таким образом, для химического связывания СО₂ необходимо нейтрализовать Н⁺. Эту задачу решает гемоглобиновая буферная система.

Роль гемоглобиновой буферной системы (связывание ионов Н⁺) существенна для транспорта CO₂ кровью (рис. 24–13, рис. 24–14).

Рис. 24–13. ПЕРЕНОС О₂ И СО₂ С КРОВЬЮ [9]. А. Влияние СО₂ и Н⁺ на высвобождение О₂ из комплекса с гемоглобином в тканях (эффект Бора). Б. Оксигенирование дезоксигемоглобина в лёгких, образование и выделение СО₂.

Рис. 24–14. Механизмы транспорта СО₂ с кровью [4]

 В капиллярах большого круга кровообращения HbO₂ отдаёт кислород, а в кровь поступает CO₂. В эритроцитах под влиянием карбоангидразы CO₂ взаимодействует с H₂O, образуется угольная кислота (H₂CO₃), диссоциирующая на HCO₃^– и H⁺. Ион H⁺ связывается с Hb (образуется восстановленный Hb — HHb), а HCO₃^– из эритроцитов выходит в плазму крови; взамен в эритроциты поступает эквивалентное количество Cl^–. Одновременно часть CO₂ связывается с Hb (образуется карбгемоглобин).

 В капиллярах лёгких (т.е. в условиях низкого pСО₂ и высокого pО₂) Hb присоединяет O₂ и образуется оксигемоглобин (HbO₂). В то же время в результате разрыва карбаминовых связей высвобождается CO₂. При этом HCO₃^– из плазмы крови поступает в эритроциты (в обмен на ионы Cl^–) и взаимодействует с H⁺, отщепившимся от Hb в момент его оксигенации. Образующаяся угольная кислота (H₂CO₃) под влиянием карбоангидразы расщепляется на CO₂ и H₂O. CO₂ диффундирует в альвеолы и выводится из организма.

Кривая диссоциации CO₂ описывает связь между содержанием в крови CO₂ и pСО₂. В отличие от кривой диссоциации Hb и О₂ (см. рис. 24–10 и рис. 24–12), кривая диссоциации CO₂ при физиологических значениях pСО₂ (кровь артериальная — 40 мм рт.ст., венозная — 46 мм рт.ст.) имеет линейный характер. Более того, при любом значении pСО₂ содержание CO₂ в крови обратно пропорционально pО₂ (насыщению Hb О₂). Эта обратная зависимость между содержанием CO₂ и парциальным давлением кислорода (pО₂) известна как эффект Холдейна. Как и эффект Бора, эффект Холдейна имеет важное физиологическое значение. Так, в капиллярах большого круга кровообращения по мере диффузии O₂ из капилляров возрастает способность крови поглощать CO₂, в результате CO₂ поступает в кровь. Напротив, в капиллярах лёгкого при оксигенация крови её способность поглощать CO₂ уменьшается, в результате CO₂ «сбрасывается» в альвеолы.

Метаболизм гемоглобина, железо организма и анемии