Ключевой особенностью ТПФ – простетической группы пируватдегидрогеназного компонента – является то, что атом углерода расположенный между атомами азота и серы в тиазоловом кольце обладает намного более кислыми свойствами (значение рКа равно приблизительно 10), чем большинство ═С― групп.

Рис. 9.2 Структурная формула тиаминпирофосфата (показан активный атом углерода тиазолового кольца, который после отщепления протона превращается в карбанион).

Этот атом углерода легко ионизуется с образованием карбаниона, который связывается с карбонильной группой пировиноградной кислоты. Положительно заряженный атом азота в тиазоловом кольце ТПФ принимает на себя электроны, обеспечивая тем самым формирование отрицательного заряда на пирувате, необходимого для декарбоксилирования последнего. В результате последующего протонирования образуется гидроксиэтил-ТПФ:

Рис. 9.3 Схема первой стадии реакции окислительного декарбоксилирования пирувата. Промежуточный продукт реакции подвергается декарбоксилированию с образованием ионизованной формы гидроксиэтил-тиаминпирофосфата.

На следующей стадии гидроксиэтильная группировка у ТПФ окисляется до ацетильной группы, которая переносится на липоамид – производное липоевой кислоты связанной амидной связью с остатком лизина трансацетилазного компонента комплекса.

Окислителем в этой реакции является дисульфидная группа липоамида, которая восстанавливается в свою дисульфгидрильную форму. Эта реакция также катализируемая пируват-дегидрогеназным компонентом (Е1) приводит к образованию ацетиллипоамида:

Рис. 9.4 Схема второй стадии реакции окислительного декарбоксилирования пирувата. В результате окисления ионизованного гидроксиэтила образуется ацетильная группа, переносимая на липоамид.

На третьей стадии ацетильная группа переносится с ацетиллипоамида на присутствующий в растворе HS-СоА, образуя ацетил-S-СоА:

Рис. 9.5 Стадия образования ацетил-СоА, катализируемая дигидролипоилтрансацетилазным компонентом пируват-дегидрогеназного комплекса.

Данная стадия катализируется дигидролипоил-трансацетилазой (Е2). При переносе ацетильной группы с ацетиллипоамида на HS-СоА сохраняется богатая энергией тиоэфирная связь. Следует отметить, что HS-CoA служит в качестве переносчика большого количества активированных ацильных групп, среди которых ацетильная группа является наиболее простой. Таким образом, ацетил-S-CoA, являющийся топливом для цикла лимонной кислоты, образуется из пирувата, который накапливается в ходе гликолитического распада глюкозы.

Пируват-дегидрогеназный комплекс не сможет вступить в следующий цикл катализа до тех пор, пока дигидролипоамид не будет снова окислен в липоамид. Поэтому на следующей стадии реакции происходит регенерация окисленной формы липоамида с участием дигидролиплил-дегидрогеназного компонента (Е3). При этом два электрона переносятся на FAD –

простетическую группу компонента Е3, а затем на NAD+ с образованием NADH (Н+). Такой транспорт электронов от FADH2 на NAD+ является необычным поскольку, как правило, FAD является акцептором электронов переносимых от NADH (Н+). Однако в данном случае при взаимодействии с ферментом величина окислительно-восстановительного потенциала FAD изменяется, что позволяет ему восстанавливать NAD+.

Подвижность связи липоамида с дигидролипоил-трансацетилазой дает возможность этому кофактору перемещаться между различными активными центрами пируват-дегидрогеназного комплекса

Несмотря на то, что структура представителей семейства пируватдегидрогеназных комплексов в интактном состоянии до сих пор не установлена на атомном уровне, по отдельности структуры всех компонентов комплекса известны, хотя эти компоненты выделены из разных комплексов различных видов организмов. Тем не менее, в настоящее время уже появилась возможность сконструировать модель комплекса (рис. 9.6), которая позволяет понять детали катализа.

Рис. 9.6 Схематическое изображение пируват-дегидрогеназного комплекса. На рисунке красным цветом показан трансацетилазный кор (Е2), пируватдегидрогеназный компонент (Е1) выделен желтым цветом и дигидролипоил-дегидрогеназа (Е3) указана зеленым цветом (Berg J.M.,

Tymoczko J.L., Lubert Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2006).

Кор комплекса построен из дигидролипоил-трансацетилазы (Е2). Трансацетилаза состоит из восьми каталитических тримеров (α3) собранных в виде полого куба. Каждая из трех субъединиц формирующих тример включает три основных домена (рис. 9.7). N-концевая последовательность каждой субъединицы формирует небольшой домен, который содержит липоамид, связанный ε-аминогруппой остатка лизина. Этот домен гомологичен биотин-связующим доменам, таким как, например, домены

пируват-карбоксилазы. За липоамидным доменом следует также небольшой домен ответственный за взаимодействие с дигидролипоил-дегидрогеназой (Е3) в составе комплекса. Крупный трансацетилазный домен завершает структуру субъединицы Е2. Субъединицы Е1 представлены тетрамерами с общей формулой α2β2, а субъединицы Е3 являются αβ-димерами. Двадцать четыре копии субъединиц Е1 и 12 копий субъединиц Е3 окружают дигидролипоил-трансацетилазный кор Е2. Каким же образом три различных каталитических сайта согласованно функционируют в составе мультиферментного комплекса?

Рис. 9.7 Структура трансацетилазного кора (Е2). Каждый красный шарик представляет собой тример состоящий из субъединиц Е2. В свою очередь каждая субъединица состоит из трех доменов: липоамидсвязующего домена, небольшого домена ответственного за взаимодействие с дигидролипоил-дегидрогеназой (Е3) и крупного каталитического трансацетилазного домена. Все три субъединицы трансацетилазного домена показаны в виде лент, а одна из них выделена красным цветом (Berg J.M., Tymoczko J.L., Lubert Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2006).

Последовательность событий, происходящих в активных центрах компонентов пируват-дегидрогеназного комплекса, выглядит следующим образом (рис. 9.8):

Рис. 9.8 Реакции пируват-дегидрогеназного комплекса. На рисунке вверху в

центре показан фермент (изображен желтым, голубым и двумя красными кружками), не модифицированный и готовый к началу катализа. 1 – декарбоксилирование пирувата с образованием гидроксиэтил-ТПФ. Реакция катализируется пируват-дегидрогеназным компонентом комплекса (Е1). 2 – липоамид, принадлежащий дигидролипоил-трансацетилазе (Е2), перемещается в активный центр Е1. 3 – Е1 катализиреут перенос двух углеродного фрагмента на дигидролипоил с образованием комплекса ацетил-липоил. 4 – Е2 катализирует перенос ацетила на HS-СоА с образованием ацетил-S- СоА. 5 – липоамид в сульфгидрильной форме перемещается в активный центр дигидролипоил-дегидрогеназы (Е3). Е3 катализирует восстановление (5) липоевой кислоты и переносит протоны и электроны (6) на NAD+ завершая реакционный цикл (Berg J.M.,

Tymoczko J.L., Lubert Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2006).

−в активном центре пируват-дегидрогеназного компонента мультиферментного комплекса происходит декарбоксилирование пировиноградной кислоты с образованием замещенного интермедиата ТПФ (гидроксиэтил-ТПФ). Этот активный центр расположен в пределах

компонента Е1 и соединяется с поверхностью фермента гидрофобным каналом длиной 20Å;

−ответвление липоамидного домена Е2, представленное липоил-лизином располагается в гидрофобном канале Е1;

−Е1 катализирует перенос ацетильной группы на липоамид. Ацетилированное липоил-лизиновое ответвление покидает Е1 и входит в куб, состоящий из Е2 через особое отверстие на боковой стороне кора размером 30Å с тем, чтобы оказаться в активном центре Е2, расположенном глубоко в коре;

−после этого ацетильная группа переносится на HS-CoA с образованием конечного продукта – ацетил-S-CoA. Восстановленная липоил-лизиновая группировка затем поворачивается к активному центру флавопротеида Е3.

−в активном центре дигидролипоил-дегидрогеназы (Е3) липоамид окисляется с участием FAD в дисульфидную форму;

−в ходе последующего окисления FADH2 образуется еще один конечный продукт – NADH (Н+), а липоамид при этом в дисульфидной форме готов к следующему раунду катализа.

Взаключение следует отметить, что описанная выше структурная интеграция трех видов ферментов в составе одного комплекса делает возможным согласованное протекание отдельных стадий такой сложной реакции как пируват-дегидрогеназная реакция. Близкое расположение одного фермента от другого повышает суммарную скорость реакции и снижает возможность протекания побочных реакций. Все интермедиаты участвующие в окислительном декарбоксилировании пирувата тесно взаимодействуют в пределах комплекса и легко переносятся от одного фермента к другому благодаря способности липоил-лизиновой группировки дигидролипоил-трансацетилазы по очереди взаимодействовать со всеми активными центрами мультиферментного комплекса.

Ниже, на рис. 9.9 приведена общая схема механизма действия всего пируват-дегидрогеназного комплекса.