Другими важными лекарственными средствами являются блокаторы кальциевых каналов, которые вызывают вазодиляцию коронарных сосудов, а также β-адренергические блокаторы. β-Блокаторы предотвращают увеличение потребности миокарда в кислороде, индуцируемое стимуляцией симпатической нервной системы сердца при физической нагрузке.

В тяжелых случаях angina pectoris, которые уже невозможно контролировать медикаментозными средствами, приходится прибегать к операции по аортокоронарному шунтированию. Во время такой операции из ноги пациента извлекают вены и вшивают их между аортой и коронарными артериями сердца. Цель такой операции заключается в том, чтобы направить кровоток в обход сосудов, пораженных атеросклерозом, и восстановить в пострадавших тканях нормальное кровообращение. Во многих случаях такое хирургическое вмешательство позволяет возвратить пациентов к полноценной жизни (Silverman K.J., Grossman M., Angina pectoris: natural history and strategies for evaluation and management, N. Engl. J. Med., 1989, 310, 1712-1721 и Hugenholtz P.G., Calcium antagonists for angina pectoris, N. Engl. J. Med., 1988, 522, 565-579).

Гипоксические повреждения тканей

Эффекты острого гипоксического повреждения тканей человека изучали на самых разных образцах. В частности закупорка одной из главных коронарных артерий при инфаркте миокарда, как известно, приводит к инициированию целого ряда биохимических и физиологических осложнений. Снижение уровня кислорода в ткани вызывает ингибирование системы окислительного фосфорилирования, что является причиной уменьшения уровня АТР и креатинфосфата в гипоксической клетке. Поскольку уровень АТР в клетке падает, происходит активация гликолитического пути утилизации глюкозы, который выступает в качестве компенсаторного механизма, поддерживающего функции клетки. В результате активации гликолитического пути быстро истощаются запасы клеточного гликогена и увеличивается цитозольная концентрация молочной кислоты, которая служит причиной снижения рН в клетке. Пораженные гипоксией клетки начинают сильно набухать вследствие неспособности поддерживать нормальный интрацеллюлярный ионный состав. Митохондрии также набухают и начинают аккумулировать кальций, который откладывается в митохондриальном матриксе в виде нерастворимой соли фосфата кальция. Плазматические мембраны пораженных (набухших) клеток становятся проницаемыми для растворимых цитоплазматических ферментов, кофакторов и других клеточных компонентов, которые выбрасываются в кровяное русло. Вследствие резкого падения внутриклеточного рН происходит существенное повреждение лизосомальных мембран, что сопровождается выбросом в цитоплазму клеток

лизосомальных протеиназ, липаз, глюкозидаз и фосфатаз. Эти чрезвычайно высокоактивные лизосомальные гидролазы инициируют аутолитическое переваривание содержимого клетки.

Хорошо известно, что те клетки, которые находились в состоянии гипоксии в течение короткого промежутка времени, обладают способностью к восстановлению своих функций при реперфузии растворами, содержащими растворенный кислород. Однако, до настоящего времени практически ничего не известно относительно того минимального периода гипоксии, когда в клетке еще не наступают необратимые изменения. Особенно большое практическое значение приобретает знание тонких механизмов, ответственных за гипоксическое состояние клеток тех органов, которые подлежат трансплантации (сердце, печень, почки). И это вполне понятно поскольку эти органы неизбежно проходят стадию гипоксии со времени их удаления из организма донора до момента имплантации в организм реципиента (Kehrer J.P., Concepts related to the study of reactive oxygen and cardiac reperfusion injury, Free Rad. Res. Commun., 1986, 5, 305-317 и Granger D.N., Role xanthine oxidase and granulocytes in ischemia – reperfusion injury, Am. J. Physiol., 1988, 255, H1269).

Субстратные циклы

Ранее уже упоминалось, что необратимая реакция гликолиза, катализируемая фосфофруктокиназой, находится под положительным аллостерическим контролем со стороны АМР. Оказалось, что в условиях низкого энергетического заряда клетки АМР может влиять на эффективность фосфофруктокиназы еще одним способом. В клетках был обнаружен фермент фруктозо-1,6-дифосфатаза, который осуществляет также необратимую реакцию гидролиза фруктозо-1,6-дифосфата до фруктозо-6- фосфата и неорганического фосфата (Рi).

Пара реакций, таких как фосфорилирование фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1,6-дифосфат и обратный гидролиз последнего до фруктозо-6- фосфата получила название субстратного цикла. К субстратным циклам относят также синтез и распад гликогена, превращение фосфоенолпирувата в пируват и обратное превращение пирувата в фосфоенолпируват через промежуточное образование щавелевоуксусной и яблочной кислот (процесс частично осуществляется в митохондриях), а также фосфорилирование глюкозы в глюкозо-6-фосфат и гидролиз глюкозо-6-фосфата с образованием глюкозы.

Наличие таких циклов долгое время объясняли несовершенством метаболической регуляции и, по этой причине, субстратные циклы иногда называли бессмысленными или холостыми циклами. Однако в настоящее время, наиболее вероятным представляется, что субстратные циклы имеют определенное биологическое значение. Например, в результате

функционирования двух ферментов – фосфофруктокиназы и фруктозо-1,6- дифосфатазы цикл, по существу, ничем не завершается, кроме расщепления АТР до ADP и Pi:

Таким образом, нетто выражение для двух этих реакций представляет собой гидролиз АТР:

Циклы такого типа обычно не приводят к гибельно быстрой потере клеткой АТР именно из-за четкого контроля метаболических процессов. В принципе, в каждый данный момент времени полностью активируется только один из двух ферментов субстратного цикла. В зависимости от метаболического состояния клетки может активно протекать процесс распада при невысоком уровне биосинтеза или активный процесс биосинтеза при слабом распаде. Таким образом, одна из возможностей состоит в том,

что субстратные циклы амплифицируют биологические сигналы. Допустим,

что скорость превращения фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1,6-дифосфат составляет 100 условных единиц, а скорость обратного процесса равняется 90 таких же условных единиц. При этом чистый выход от функционирования двух реакций составляет 10 условных единиц.

Примем, что аллостерический эффектор (АМР) повышает скорость прямой реакции фруктозо-6-фосфат → фруктозо-1,6-дифосфат на 20% (т.е. до 120 условных единиц) и, реципрокно, снижает скорость обратной реакции фруктозо-1,6-дифосфат → фруктозо-6-фосфат также на 20% (до 72 условных единиц). В таком случае новый чистый выход фруктозо-1,6-дифосфата теперь составит уже 48 условных единиц.

Таким образом, изменение всего лишь на 20% скоростей противоположно направленных реакций приводит к повышению чистого выхода всего субстратного цикла с образованием фруктозо-1,6-дифосфата на

480%.

Злокачественная гипертермия

Другая потенциальная биологическая роль субстратных циклов состоит в том, чтобы генерировать тепло, продуцируемое при гидролизе АТР. Отсюда следует, что если в норме субстратные циклы находятся под строгим контролем, то при патологических состояниях они, по-видимому, могут служить источником неконтролируемого выделения тепла.

Действительно, у пациентов со злокачественной гипертермией многие агенты, особенно широко используемый анестетик общего назначения – галотан, вызывают опасное повышение температуры тела, метаболический и респираторный ацидозы, гиперкалиемию и отвердение мышц.

Во многих случаях даже чрезвычайные меры не могут спасти больного от быстрой смерти. Это генетически обусловленное нарушение терморегуляции (в присутствии отдельных химических агентов) встречается у одного из 15 000 детей и одного из 50 000 – 100 000 взрослых. Заболевание наследуется, как доминантный признак. Часто смерть наступает у чувствительных к галотану пациентов в первое же время после применения анестетика. Начало повышения температуры происходит буквально в пределах нескольких минут, поэтому гипертермию необходимо уметь распознавать немедленно. В настоящее время при злокачественной гипертермии больного сразу же помещают в лед и предпринимают попытки устранения ацидоза посредством введения современного препарата – дантролена.

Биохимические основы гипертермии до сегодняшнего дня очень плохо изучены. Схожий, если не идентичный феномен обнаружен у свиней некоторых пород. Свиньи этих пород плохо реагируют на стресс и, в момент стресса, у них происходит резкое увеличение температуры, сопровождаемое судорогами мыщц и сильным снижением в мышцах содержания АТР. Интересной особенностью свиней с такой реакцией на стресс является высокая чувствительность к галотану, которая наблюдается у людей со злокачественной гипертермией. Мясо свиней, погибших от указанного синдрома бледное, водянистое с очень низким значением рН (т.е. практически «замаринованное»).

Полагают, что именно мышечная ткань поражается в первую очередь как при злокачественной гипертермии у людей, так и при стрессовом синдроме у свиней. В ответ на действие галотана скелетная мускулатура становится твердой, интенсивно генерирует тепло и молочную кислоту. Как считают некоторые исследователи, за опасное увеличение температуры ответственна гликолитическая активность, а также неконтролируемое функционирование субстратного цикла, ответственного, в данном случае, за ускоренный гидролиз АТР:

Действительно, как было показано, галотан ускоряет субстратный цикл у экспериментальных свиней на уровне фосфофруктокиназа/фруктозо- 1,6-дифосфатаза. Возможно, что у пациентов со злокачественной гипертермией имеет место дефект одного из ферментов цикла в отношении взаимодействия с молекулами аллостерического контроля.

Имеются также доказательства того, что при злокачественной гипертермии саркоплазматический ретикулум клеток скелетных мышц характеризуется

нарушениями структуры кальциевых каналов, а анестетик выступает в роли триггера, который запускает неадекватное высвобождение Ca+2 из саркоплазматического ретикулума. В свою очередь, высвобождение Ca+2 может приводить к неконтролируемой стимуляции ряда теплопродуцирующих процессов таких, как активация миозин-АТР-азы, повышение эффективности гликогенолиза и гликолиза. Показано также, что при злокачественной гипертермии наблюдается циклическое поглощение и выброс Ca+2 как митохондриями, так и саркоплазматическим ретикулумом клеток скелетных мышц (Mitchell G., Heffron J.J.A., van Rensberg A.J.J., A halothane-induced biochemical defect in muscle of normal and malignant hyperthermia-susceptible land-race pigs, Anesth. Analg., 1980, 59, 250-263, Nelson T.E., Sarcoplasmic reticulum function in malignant hyperthermia, Cell Calcium, 1988, 9, 257-269 и Michelson J.R., Gallant E.M., Litterer L.A., Johnson K.M., Rempel W.E., Louis C.F., Abnormal sarcoplasmic reticulum

ryanodine receptors in malignant hyperthermia, J. Biol. Chem., 1989, 263, 93109321).

Другим известным субстратным циклом является пара реакций,

катализируемых глюкокиназой и глюкозо-6-фосфатазой:

Как видно из приведенной выше схемы, совместное действие глюкокиназы и глюкозо-6-фосфатазы поддерживает функционирование субстратного цикла, также обеспечивающего гидролиз АТР без совершения работы. Вместе с тем и этот «бессмысленный» цикл характеризуется существенным биологическим значением. Оказывается, что в тех случаях, когда концентрация глюкозы в крови составляет примерно 5 mM, активность глюкокиназы почти полностью уравновешена противоположной активностью глюкозо-6-фосфатазы. Этот цикл некоторым образом понижает уровень АТР, но в сочетании с процессом глюконеогенеза отвечает за «буферное» действие печени в отношении поддержания постоянной концентрации глюкозы в крови. Более того, этот цикл представляет собой защитный механизм, оберегающий глюкокиназу от полного связывания всего неорганического фосфата.

Субстратный цикл с участием фруктозо-2,6-дифосфата

К субстратным циклам можно отнести также еще одну пару реакций, в которых участвуют фосфорилированные сахара. Эти реакции обеспечивают синтез фруктозо-2,6-дифосфата из фруктозо-6-фосфата, с одной стороны, и гидролиз фруктозо-2,6-дифосфата снова до фруктозо-6-фосфата, с другой стороны:

Фруктозо-2,6-дифосфат, вероятно, присутствует в клетках всех тканей, однако его участие в регуляции гликолиза лучше всего изучено в печени.

Роль фруктозо-2,6-дифосфата, подобно роли АМР, сводится к функционированию в качестве положительного аллостерического

напоминает аденилаткиназу по наличию NTPазного домена имеющего форму Р-петли, в то время как фруктозо-2,6-дифосфатаза похожа на фосфоглицеромутазу. Напомним, что мутаза по существу является фосфатазой. Обнаруживаемая в этом бифункциональном ферменте фосфатазная активность необходима для того, чтобы фермент в целом проявлял специфичность именно к фруктозо-2,6-дифосфату. Полагают, что такой бифункциональный фермент мог возникнуть в ходе эволюции вследствие слияния генов исходно кодирующих киназу и фосфатазу в отдельности.

В последнее время удалось установить, что этот бифункциональный фермент существует в виде пяти изозимных форм (изоформ) которые отличаются размерами, кинетическими характеристиками, а также иммунологическими и регуляторными свойствами. Напомним, что изоферменты или изозимы в целом обладают одинаковым строением и каталитическими свойствами, но отличаются регуляцией их активности. Доказано, что L-изоформа белка, которая преобладает в печени, и М- изоформа обнаруживаемая в мышечной ткани, образуются в результате альтернативного сплайсинга первичного РНК-транскрипта, синтез которого направляется единственным геном. При этом установлено, что L-изоформа фосфофруктокиназы-2 принимает участие в поддержании постоянного уровня глюкозы в крови.

Высокая концентрации глюкозы в крови приводит к повышению концентрации фруктозо-6-фосфата в печени, и как следствие высокий уровень фруктозо-6-фосфата ускоряет синтез фруктозо-2,6-дифосфата. Таким образом, избыток фруктозо-6-фосфата приводит к образованию более высокой концентрации фруктозо-2,6-дифосфата, который в свою очередь стимулирует каталитическую активность фосфофруктокиназы. Такой процесс называется регуляцией по принципу прямой связи. Что же отвечает за доминирование в каждый момент времени той или иной активности (киназной или фосфатазной) бифункционального фермента в печени? Киназная и фосфатазная активности реципрокно контролируются путем фосфорилирования/дефосфорилирования единственного остатка серина в регуляторном домене фосфофруктокиназы-2. Низкий уровень глюкозы в крови служит сигналом увеличения продукции α-клетками поджелудочной железы глюкагона. Образующийся гормон связывается с глюкагоновыми рецепторами 7ТМ, расположенными на внешней стороне плазматических мембран гепатоцитов. Связывание гормона с рецептором 7ТМ приводит в действие аденилат-циклазную систему путем передачи сигнала от рецептора на GSα (см. рис. 8.3). Эти события инициируют фосфорилирование бифункционального фермента под действием протеин-киназы А. Такая ковалентная модификация фермента активирует его фосфатазную активность и ингибирует киназную активность, что снижает уровень фруктозо-2,6-дифосфата в гепатоцитах. Уменьшение концентрации

фруктозо-2,6-дифосфата в клетках печени приводит к снижению активности фосфофруктокиназы и, одновременно, к увеличению активности фруктозо- 1,6-дифосфатазы. (Claus T.H., et al. The role of fructose-2,6-bisphosphate in regulation of carbohydrate metabolism, Curr. Topics Cell Regul., 1984, 23, 5773). Таким образом, интенсивность распада глюкозы в печени снижается. И, наоборот, при высокой концентрации глюкозы в крови бифункциональный фермент подвергается дефосфорилированию с участием фосфопротеин фосфатазы (рис. 8.3). Это приводит к стимулированию киназной активности фермента и угнетению фосфатазной активности повышая, тем самым, уровень фруктозо-2,6-дифосфата и ускоряя гликолиз. Описанный выше координированный контроль активности фосфофруктокиназы-2 облегчается благодаря присутствию регуляторного, киназного и фосфатазного доменов в пределах одной полипептидной цепи.

Рис. 8.3 Контроль синтеза и распада фруктозо-2,6-дифосфата. Низкий уровень глюкозы в крови с участием глюкагона приводит к фосфорилированию бифункционального фермента фосфофруктокиназы-2 и, как следствие, к снижению концентрации фруктозо-2,6-дифосфата, что уменьшает эффективность гликолиза. Высокая концентрация фруктозо- 6-дифосфата ускоряет образование фруктозо-2,6-дифосфата за счет дефосфорилирования бифункционального фермента c участием фосфопротеин фосфатазы (Berg J.M., Tymoczko J.L., Lubert Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2006).

Регуляторная роль пируваткиназы

В регуляции гликолитического пути, как упоминалось ранее, также принимает участие пируваткиназа, которая катализирует третью необратимую реакцию гликолиза – реакцию образования пировиноградной кислоты из фосфоенолпирувата с одновременным переносом активированного фосфорильного остатка на ADP:

Однако, не смотря на регуляторную роль данного фермента, пируваткиназу подобно гексокиназе следует рассматривать как вторичное место регуляции гликолиза. Этот фермент настолько сильно ингибируется физиологическими концентрациями АТР, что его потенциально полная активность никогда не реализуется в клетке.

В целом пируваткиназа представляющая собой тетрамерный белок с молекулярной массой 57 кДа/субъединицу контролирует выход из гликолитического пути распада глюкозы при этом образующаяся пировиноградная кислота выступает в роли центрального метаболического интермедиата, который может быть либо окислен далее до СО2 и Н2О, либо использован в качестве строительного блока. У млекопитающих обнаружено несколько изоформ пируваткиназы кодируемых разными генами: изоформа L-типа преобладает в печени, а изоформа пируваткиназы М-типа присутствует в мышцах и мозге. Свойства L- и М-изоформ пируваткиназы во многом похожи. Обе изоформы отличаются кооперативным характером связывания фосфоенолпирувата. Фруктозо-1,6-дифосфат – продукт основной необратимой реакции гликолиза активирует обе изоформы фермента, что позволяет им «справляться с высокой скоростью надвигающегося потока» интермедиатов. С другой стороны АТР аллостерически ингибирует как L-, так и М-форму пируваткиназы, что обеспечивает замедление гликолиза в условиях высокого энергетического заряда. Наконец, аланин (синтезирующийся в одну стадию в ходе реакции переаминирования пирувата с глутаминовой кислотой) также аллостерически ингибирует пируваткиназу – в этом случае аланин выполняет функцию сигнала о том, что строительных блоков в клетке достаточно.

Изоформы пируваткиназы отличаются чувствительностью к ковалентной модификации. Каталитические свойства L-изоформы, но не М-изоформы регулируются путем обратимого фосфорилирования. В тех случаях, когда

уровень глюкозы в крови низок каскад реакций, опосредуемый глюкагоном, через промежуточное образование сАМР приводит к фосфорилированию L- изоформы пируваткиназы, что снижает ее каталитическую активность (см. рис. 8.4). Такие зависимые от действия гормонов акты фосфорилирования, подобно тому, как это имеет место в случае бифункционального фермента контролирующего уровень фруктозо-2,6-дифосфата, не позволяют печени поглощать глюкозу, когда она более необходима мозгу и мышцам. Здесь мы видим яркий пример того, как изоферменты способствуют метаболическому разнообразию различных органов.

Рис. 8.4 Регуляция пируваткиназы. Фермент аллостерически ингибируется избытком АТР, ацетил-СоА и длинноцепочечных жирных кислот, в то время как накопление фруктозо-1,6-дифосфата приводит к его активации. Накопление аланина, который может синтезироваться из пирувата в одну стадию, приводит к аллостерическому ингибированию пируваткиназы, что замедляет образование пирувата

входе гликолиза. Изоформа пируваткиназы печени (L-форма) находится также под гормональным контролем; глюкагон активирует сАМР-зависимую протеинкиназу А, которая фосфорилирует печеночную L-изоформу фермента и инактивирует ее. При снижении уровня глюкагона в крови протеин-фосфатаза дефосфорилирует пируваткиназу и, тем самым, приводит к ее активации. Этот механизм не позволяет печени расходовать глюкозу

входе гликолиза когда уровень данного сахара в крови понижается. Вместо этого печень экспортирует глюкозу в кровяное русло. В противоположность этому мышечный изофермент пируваткиназы (М-форма) не подчиняется контролю с использованием механизма фосфорилирования/дефосфорилирования (Nelson D.L., Cox M.M., Lehninger Principles of Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2004).

На рис. 8.5 приведена схема контроля каталитической активности печеночной пируваткиназы. Как следует из этого рисунка, фермент печени подвергается ковалентной модификации, активируясь при дефосфорилировании и утрачивая активность в фосфорилированном состоянии. Инактивация печеночной пируваткиназы происходит путем фосфорилирования под действием протеинкиназы А, зависящей от сАМР.

Рис. 8.5 Контроль каталитической активности печеночной пируваткиназы. Пируваткиназа контролируется аллостерическими эффекторами и ковалентной модификацией (Berg J.M., Tymoczko J.L., Lubert Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2006).

Хорошо известно, что в зрелых эритроцитах вся потребность в АТР удовлетворяется исключительно за счет гликолиза. В эритроцитах АТР необходим для функционирования ионных насосов, в особенности для функционирования Na+,K+-ATPазы, которая обеспечивает поддержание физиологической формы двояковогнутых дисков этих клеток. Это означает, что при недостатке АТР эритроциты склонны к набуханию и лизису. Анемия, обусловленная избыточным разрушением эритроцитов, получила название

гемолитической анемии.

Нехватка или отсутствие пируваткиназы является достаточно редким, но, в значительной степени, наиболее общим генетическим дефектом гликолиза. У большинства пациентов уровень активности пируваткиназы составляет 5-25% от нормального уровня фермента в эритроцитах, что приводит к существенному снижению концентрации АТР в этих клетках. Вполне объяснимо, что при дефиците пируваткиназы, в эритроцитах накапливаются интермедиаты, предшествующие пируваткиназной стадии гликолиза, в то время как уровень пирувата и молочной кислоты понижается.