Алгоритм лабораторної роботи
Підготовка робочої, дослідної і контрольної проб (за стандарт-ною методикою).
Вимірювання оптичної густини (екстинкції) робочої і дослідної проб проти контролю (дистильована вода).
Розрахунок активності амілази крові за формулою і оцінка результатів дослідження.
Методика проведення експериментів
Визначення активності амілази у сироватці крові за методом Каравея
Принцип методу: метод базується на колориметричному визначенні залишку нерозщепленого крохмалю за інтенсивністю його забарвлення з йодом. За одиницю амілази крові взята кількість мг крохмалю, гідролізованого 1 мл сироватки за 1 год.
Хід роботи: роботу виконують у мірних колбах на 50 мл, які заповнюють у відповідності до таблиці.
|
Реактив |
Робоча проба, мл |
Дослідна проба, мл |
|
Крохмальний субстрат |
5 |
5 |
|
Інкубація в термостаті 5 хв. при 370С | ||
|
Сироватка крові |
- |
0,1 |
|
Перемішування, інкубація в термостаті 7,5 хв. при 370С | ||
|
Сироватка крові |
0,1 |
- |
|
Робочий розчин йоду |
5 |
5 |
Об΄єм реакційних сумішей у колбочках доводять дистильованою водою до 50 мл і відразу вимірюють екстинкцію розчинів при червоному світлофільтрі (довжина хвилі 630 - 690 нм) у кюветі товщиною 10 мм проти дистильованої води (контроль).
Розрахунок
Ер - Ед
Дк = · 2
· 80,
Ер
де Дк – діастаза крові (мг/мл · год або г/л · год);
Ер – екстинкція робочої проби;
Ед – екстинкція дослідної проби;
2 – кількість крохмалю, внесеного у робочу і дослідну проби, мг;
80 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки і 1 год інкубації.
Клініко-діагностичне значення. Визначення активності α-амілази крові й сечі широко використовується у клінічній практиці з метою діагностики захворювань підшлункової залози. Амілаза – один із екскреторних ферментів, які всмоктуються в кров з тонкого кишечника і виділяються з сечею як низькомолекулярні білки. У нормі активність амілази в крові дорівнює 12-30 мг/мл·год (або г/л·год). Нормальні значення активності α-амілази сечі (діастаза), яка визначена за Вольгемутом, варіюють в межах 16-64 одиниць. Цей показник широко використовується в клінічній практиці з діагностичною метою.
При гострих панкреатитах діастаза зростає в 10-30 разів, особливо у першу добу, потім поступово нормалізується. Хронічний панкреатит, рак підшлункової залози не супроводжу-ються різким підвищенням активності діастази. Деяке зростання активності амілази може супроводжувати паротит у дітей. При нирковій недостатності амілаза в сечі відсутня.
Після проведення експериментальної частини ви повинні оформити протокол лабораторної роботи.
Виконайте завдання та перевірте правильність їх розв’язання з еталоном відповіді.
Завдання 1
У хворого з гострим панкреатитом у крові та сечі різко підвищена активність одного із зазначених ферментів, що підтверджує діагноз. Назвіть цей фермент.
А. α-амілаза.
В. Пепсин.
С. Дипептидаза.
Д. Сахараза.
Е. Лактаза.
Еталон відповіді: А.
Завдання 2.
Після відкриття нового складного ферменту Е було розроблено методику визначення його активності. В основу цієї методики могли бути покладені принципи визначення активності ферментів, які подані нижче, крім:
А. Визначення концентрації субстрату в ході реакції.
В. Визначення зміни концентрації продуктів у ході реакції.
С. Створення оптимальних умов реакції (рН, t0С, наявність коферменту в середовищі).
Д. Визначення концентрації ферменту.
Е. Використання високих концентрацій субстрату, які не лімітують проходження реакції.
Еталон відповіді: Д.
Завдання 3.
При визначенні активності сечі за методом Вольгемута отримали такі результати
|
Показник |
Пробірка | |||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 | |
|
Розведення сечі |
2 |
4 |
8 |
16 |
32 |
64 |
128 |
256 |
|
Результат йодної проби (+ -позитивний) |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
Зробіть розрахунок активності амілази за формулою
Х = 1·2·розведення сечі (одиниць).
1 Який висновок про активність цього ферменту в сечі ви зробите?
А. Активність в межах норми.
В. Активність нижче норми.
С. Активність вище норми.
Еталон відповіді: С.
2 Який діагноз можна припустити?
А. Рак підшлункової залози.
В. Хронічний панкреатит.
С. Ниркова недостатність.
Д. Гострий панкреатит.
Еталон відповіді: Д.
Короткі методичні вказівки до роботи студентів на практичному занятті
Заняття починається з вирішення навчальних задач, після чого необхідно виконати досліди лабораторної роботи.
У кінці заняття проводяться тестовий контроль, аналіз результатів роботи, в яких беруть участь всі студенти під керівництвом викладача.