Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
ется МДА, в отсутствие ионов железа либо восстановленных пиридиннуклеотидов этого не наблюдается (рис. 5.3.1).
Рис. 5.3.1. Накопление МДА при инкубации (37°С)
микросом печени омуля в средах с разными добавками:
1- 4 – 5•10
-2
М трис-HCl-буфер, рН 7,4; 2 – 5•10-4 М НАДФН
-5
и 5•10
М Fe2+; 3 – 5•10-4 М НАДН и 5•10-5 М Fe2+;
4 – аскорбат и 5•10
-5
М Fe2+
Из данных, представленных в табл. 5.3.1, видно, что начальные скорости пиридиннуклеотидзависимого ПОЛ в микросомах печени изученных видов рыб различаются незначительно.
Ферментативная природа этого типа ПОЛ подтверждается
ингибирующим действием на процесс блокаторов сульфгидрильных групп n-хлормеркурибензоата и N-этилмалеимида
(в концентрации 1мМ), а также нагревания при 80°С в течение
3 мин. При сопоставлении начальной скорости ПОЛ с началь-
ной скоростью НАДФН-цитохром Р-450-редуктазной реакции
и содержания цитохрома Р-450 во фракциях микросом печени
нами обнару
тивного ПОЛ и активностью НАДФН-
жена корреляция между активностью фермента-
зависимой редуктазы
81
(r = +0,82). В то же время начальная скорость ПОЛ не зависит
от содержания цитохрома Р-450 в мембранах микросом
(r = -0,91). Это позволяет заключить, что у рыб, как и у млеко-
питающих, существенную роль в ферментативной генерации
АФК и ПОЛ играет начальный компонент НАДФН-зависимой
электронтранспортной цепи флавопротеид, а не терминальный
компонент цитохром Р-450.
Начальные скорости ферментативного и неферментативного ПОЛ
в микросомах из печени байкальских рыб
Таблица 5.3.1
Система
индукции
ПОЛ
НАДФН
2+
+Fe
НАДН
2+
+ Fe
Аскорбат
2+
+ Fe
нмоль
Омуль Плотва Елец Окунь Хариус
2,45+0,23 0,75+0,15 1,30+0,12 0,32+0,09 0,48+0,04
2,36+0,19 0,61+0,13 1,10+0,09 0,75+0,10 1,00+0,40
1,80+0,21 0,72+0,10 0,91+0,10 1,00+0,12 0,35+0,02
Количество образованного МДА,
•
мин-1 на 1 мг белка микросом из печени рыб
В этих же мембранах может быть индуцировано нефер-
2+
ментативное (Fe
+аскорбат)-зависимое ПОЛ; при этом в мик-
росомах из печени рыб, в отличие от микросом из печени млекопитающих, неферментативный процесс протекает практически с той же эффективностью, что и ферментативный, или менее интенсивно (табл. 5.3.1). При сравнении ПОЛ в микросомах
печени рыб и крыс очевидно, что скорость как НАДФН-, так
и аскорбатзависимого ПОЛ в печени крыс существенно выше
в 2,5 раза). Поскольку в микросомах печени рыб содержится
(
гораздо больше ПНЖК с пятью и шестью двойными связями
(Gunstone, 1967) – основных субстратов ПОЛ, указанные раз-
личия в интенсивности этого процесса могут быть связаны
с разницей в активности пиридиннуклеотидзависимых систем
генерации АФК (соответствующих редуктаз в ЭР гепатоцитов
рыб и крыс). Действительно, активность НАДФН-цитохром с –
82
редуктазы микросом печени крыс более чем в 50 раз выше, чем
таковая у рыб. Эти различия не зависят от активности ферментных генераторов АФК, так как сохраняются и при развитии
неферментативного аскорбатзависимого ПОЛ. Исходя из этого
факта, должны существовать дополнительные ферментативные
факторы регуляции ПОЛ в микросомных мембранах печени
рыб, основными из которых являются антиоксиданты эндогенной природы (токоферол, убихинол и т.д.) и образу
в результате пиридиннуклеотидзависимого
генных
гидрофобных субстратов (Miles et al., 1980).
метаболизма экзо-
ющиеся
5.4. Роль фенольных производных бенз(а)пирена
и фенолов – компонентов промстоков в регуляции
процесса окисления липидов в микросомах печени рыб
озера Байкал
Микросомы печени рыб, в том числе, как мы показали,
байкальских, обладают арилу
ностью, катализиру
ющей образование фенольных производных
глеводород-гидроксилазной актив-
из ароматических полициклических углеводородов (Арчаков
и др., 1968). Этим фенольным производным присущи антиоксидантные свойства. Вот почему добавление в среду инкубации
БП – одного из основных загрязнителей полициклического ряда –
приводило к ингибированию НАДФН-зависимого ПОЛ в микро-
2+
сомах печени рыб. При неферментативном (Fe
+аскорбат)-
зависимом ПОЛ, когда не образуются гидроксилированные производные БП, ингибирования ПОЛ не происходило. Поскольку
на долю гидроксилированных продуктов при НАДФНзависимом метаболизме БП приходится не более 20% общего
количества продуктов его окислительных превращений, можно
заключить, что фенольные производные ароматических углеводородов являются высокоэффективными ингибиторами ПОЛ.
Это явление может иметь функциональное значение. ПОЛ,
казывалось выше, является механизмом разборки индуци
как у
-
рованных для реакций гидроксилирования ферментных структур
монооксигеназной системы после исчерпывания субстратов. Об-
83
разование же фенольных антиокислительных производных в процессе реакций гидроксилирования может, по-видимому, ограничивать накопление продуктов перекисного окисления мембранных фосфолипидов микросом, тем самым стабилизируя и поддерживая в активном состоянии изоформы цитохрома Р-450,
ответственные за метаболизм тех или иных ксенобиотиков.
Оценивали эффективности ингибирования ПОЛ одно-
и многоатомными фенолами (пирогаллол, пирокатехин, гидрохинон, коричная и галловая кислоты, резорцин и фенол). Определяли константы 50% ингибирования НАДФН-зависимого
и аскорбатзависимого ПОЛ в микросомных фракциях печени
некоторых видов байкальских рыб: ому
ля, хариус
а, ельца, плотвы, окуня. Во всех случаях константы лежали преимущественно
в диапазоне 1 – 6 (-lg C
). На рис. 5.4.1 представлены эти
фенолов
константы для трех видов рыб и семи фенольных соединений.
Очевидно, что фенолы являются высокоэффективными
ингибиторами ПОЛ микросом печени рыб. В сравнительных
экспериментах с микроcомами печени млекопитающих (крысы)
было обнаружено существенно менее выраженное антиоксидантное действие, чем в микросомах печени рыб. Более того,
в микросомах печени крыс некоторые фенолы (гидрохинон,
фенол, резорцин) стиму
с ПОЛ связано
обновление мембранных фосфолипидов при
лировали процесс ПОЛ. Известно, что
участии фосфолипаз типа А (Каган и др., 1978), имеющих адаптационное значение (Хакачка и Семеро, 1977), а также синтез
внутриклеточных гормонов (простагландинов, лейкотриенов)
(Samuelsson et al., 1980). Можно полагать, что потенциально
фенолы способны оказывать токсическое и повреждающее действие, блокируя эти важнейшие для физиологии клетки, да
и организма в целом, процессы. Однако, что касается содержания в воде озера Байкал фенольных производных и даже содержания их в очищенных сточных водах (по жесткому санитарно-гигиеническому регламенту ПДК), то концентрация этих
соединений меньше на четыре порядка величины, чем вытекает
из нашей оценки констант 50% ингибирования (10
-1
против 10
-7
-10
М). Поэтому вряд ли можно ожидать их токси-
-9
– 10
-11
М
ческое действие на метаболические структурно-функциональ-
84
ные системы байкальских рыб в условиях их естественного
обитания и даже воздействия очищенных сточных вод. Вместе
с тем ПОЛ является универсальным триггерным механизмом,
обеспечивающим разборку внутриклеточных структур, в том
числе системы монооксигеназ со смешанной функцией в ЭР
печени. Наиболее чувствительным к действию ПОЛ в этой системе является цитохром Р-450 (Каган и др., 1974). Ингибирующее действие фенолов на ПОЛ должно приводить к снижению
скорости распада цитохрома Р-450.
а
б
Рис. 5.4.1. Эффективность ингибирования фенолами
НАДФН-зависимого (а) и аскорбатзависимого (б) ПОЛ
в микросомах печени ельца (I), плотвы (II) и омуля (III):
1 – пирогаллол; 2 – пирокатехин; 3 – гидрохинон;
4 – коричная кислота; 5 – галловая кислота; 6 – резорцин; 7 – фенол.
Представлены величины логарифмов констант
50%-ного ингибирования
85
В микросомных фракциях печени байкальских рыб содержание цитохрома Р-450, активностей НАДФН-цитохром
Р-450 редуктазы, БП-гидроксилазы существенно более низкое,
чем в печени других пресноводных и морских рыб, а тем более
теплокровных животных. Эти данные хорошо интерпретируются на основе того, что в байкальской воде содержатся очень
низкие концентрации индукторов монооксигеназ. Учитывая,
что такие условия могут обу
словливать чрезвычайно низкий
уровень индукции цитохрома Р-450 в печени байкальских рыб,
можно сделать вывод, что стабилизирующее действие фенолов
на цитохром Р-450 в случае возможного повышения их содержания в воде должно приводить к увеличению времени полужизни цитохрома, а, следовательно, к повышению его стационарной концентрации.
Фенольные соединения, как потенциальные антиоксиданты, даже находясь в воде в низких концентрациях, будут способны замедлять время жизни цитохрома Р-450, ингибируя
ПОЛ, способству
ингибирования ПОЛ необходимы концентрации
соединений не ниже 10
я детоксикации ксенобиотиков. Если для 50%
фенольных
-6
– 10-7 М, то при их более низких кон-
центрациях, даже если они будут тормозить ПОЛ на 10-20%,
уже станет возможной достаточно заметная детоксикация загрязнителей. При этом вряд ли будут проявляться токсические
свойства фенолов и их производных, так как исходный уровень
их содержания в воде не достигает токсичных величин.
Следует также отметить, что подавление распада цитохрома Р-450 в результате ингибирования фенолами ПОЛ в мембранах ЭР печени должно поддерживать на более высоком
ровне эффективность
у
системы
детоксикации, а, следовательно,
и устойчивость гидробионтов к действию антропогенных загрязняющих веществ.
Таким образом, в микросомных фракциях печени рыб озера Байкал имеются ферментные системы генерации АФК
и перекисей липидов, способные выступать в качестве регуляторов метаболизма гидрофобных ксенобиотиков. С другой
86
стороны, фенольные соединения как экзогенного, так и эндогенного происхождения (продукты гидроксилирования ксенобиотиков), являясь высокоэффективными ингибиторами ферментативного и неферментативного ПОЛ, следовательно,
также выступают регуляторами НАДФН-зависимой системы
детоксикации загрязнителей.
87
ГЛАВА VI
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ
ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИЗА
ФОСФОЛИПИДОВ ФОСФОЛИПАЗОЙ А
2
НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ
МИКРОСОМНОЙ СИСТЕМЫ ПЕЧЕНИ КРЫС И РЫБ
6.1. Ингибирование деалкилазной активности
изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени
продуктами гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А
2
Система микросомного окисления требует для своего
функционирования наличия фосфолипидов (Strobel et al., 1970;
Дятловицкая и др., 1984). Одним из подходов для изучения роли липидов в этой системе является использование фосфолипаз.
Накопление продуктов гидролиза фосфолипидов – лизофосфолипидов (ЛФ) и СЖК в мембранах клеток может приводить
к структурным нарушениям, ингибированию ферментативных
активностей, инактивации мембранных белков, таких, как цитохром Р-450. В физиологических ус
ловия
х при метаболизме
фосфолипидов в мембранах этого типа содержатся небольшие
количества СЖК и ЛФ, не превышающие 6% (Bjornstad, 1966).
При изучении действия фосфолипазы А
(ограниченный
2
гидролиз) на ЭКОД в микросомах из печени интактных крыс
нами было обнаружено эффективное ингибирование этой реакции, причем 50% ингибирование происходило при гидроксилировании 5% фосфолипидов и соответствовало накоплению
22,6+
2,3 и 13,0+1,5 мкг ЛФ и СЖК на 1 мг белка за 5 мин. Та-
кая степень гидролиза изменяла спектр поглощения цитохрома
Р-450, т.е. вызывала превращение его в неактивный цитохром
Р-420 (рис. 6.1.1).
88
Рис. 6.1.1. Изменение содержания цитохрома Р-450 в микросомах
из печени крысы в присутствии фосфолипазы А
и продуктов
2
гидролиза фосфолипидов. Содержание цитохрома Р-450 и Р-420
в микросомах из печени интактных крыс (а),
после внутрибрюшинной инъекции МХ (б) или ФБ (в):
1 – без воздействий; 2 – после инкубации в течение 5 мин
в присутствии фосфолипазы А
(0,175 ед./мг белка микросом);
2
3 – в присутствии МЛЛ в количествах (мкг/мг белка микросом):
2,3 – для интактных микросом; 57,5+1,1 – для ФБ-микросом,
22,6+
0,9 – для МХ-микросом.
105,5+
Использованные количества МЛЛ соответствуют количествам ЛФ,
образующихся при гидролизе фосфолипидов соответствующих
микросом фосфолипазой А
2
При добавлении γ -миристоил- или γ -пальмитоил лизолецитина (МЛЛ и ПЛЛ соответственно) к суспензии микросом
ЭКОД также ингибировалась, причем действие лизолецитина
в пределах концентраций ЛФ, образующихся при гидролизе
фосфолипидов фосфолипазой А
, оказывалось аналогичным
2
89
действию самой фосфолипазы. Было показано, что ингибирующее действие МЛЛ или ПЛЛ ЛФ на О-деэтилирование 7-ЭК количественно было одинаковым и не зависело от состава освобождающихся при гидролизе фосфолипидов СЖК. Поэтому
в дальнейших экспериментах использовали преимущественно
МЛЛ.
Чувствительность ЭКОД микросом из печени крыс исследовали после введения им ФБ (ФБ-микросомы) или МХ (МХмикросомы) к действию фосфолипазы А
, МЛЛ и олеиновой ки-
2
слоты. Глубина гидролиза фосфолипидов в ФБ-микросомах составляла 11,3%, а в МХ-микросомах – 25,0%, т.е. в 2,5 и 5 раз
больше, чем в интактных микросомах. Однако, несмотря на различия в скорости гидролиза фосфолипидов, скорость реакции
О-деэтилирования 7-ЭК в МХ- и ФБ-микросомах снижалась
одинаково. В МХ-микросомах образу
ется более устойчивая форма цитохрома Р-450, чем CYT2B1 в ФБ-микросомах по отношению к действию низких
концентраций ЛФ на ЭКОД. При изучении концентрационной зависимости действия МЛЛ оказалось,
что в интактных микросомах окисление 7-ЭК осуществляет изоформа CYT1A1. Полученные результаты могут иметь важное
значение для изучения способов регуляции активности монооксигеназной системы как in vitro, так и in vivo. Регуляция гидролиза фосфолипидов в мембранах эндоплазматического ретику
лума,
по-видимому, может воздействовать не только на активность
монооксигеназной системы
, т.е. на скорость генерации АФК
и гидроксилирования конкретных эндогенных субстратов и ксенобиотиков, но может также играть важную роль в адаптации
животных к температурным изменениям окру
Было ус
тановлено, что скорости монооксигеназных реак-
жающей среды.
ций зависят от изменяемости соотношения форм цитохрома
Р-450 и фосфолипидов, а степень такой зависимости, вероятно,
определяется как свойствами субстратов, так и специфическими особенностями ответственных за их метаболизм форм цитохрома Р-450. Модификация липидного микроокружения цитохрома ЛФ также может в разной степени оказывать влияние
на скорости монооксигеназных реакций. Ввиду того, что харак-
90
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]