Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
размера или лентовидной формы. В этих случаях практически
невозможно полностью отмыть печень от крови, поэтому и использовали метод Johannesen and de Piere (1978). Принцип этого
метода заключается в следующем. Чтобы компенсировать
вклад гемоглобина в поглощение, сначала барбатировали СО
две кюветы с образцами суспензии микросом, а затем в одну из
кювет добавляли дитионит. В этом случае кювета сравнения
содержала СО-гемоглобин и окисленный цитохром Р-450 в то
время, как другая кювета содержала СО-гемоглобин и восстановленный комплекс цитохрома Р-450 и монооксида у
При
этой процедуре ослаблялся пик 424 нм, но пик поглощения
глерода.
цитохрома Р-450 оставался значительным. Помимо СОгемоглобина в кювете сравнения содержался и метгемоглобин,
тогда как в другой кювете метгемоглобин был восстановлен
дитионитом. Остаточный пик при 424 нм мог определятся различием в количестве СО-гемоглобина в обеих кюветах. Поэтому для того, чтобы элиминировать этот пик, необходимо восстановление метгемоглобина в кювете сравнения, но при этом
не должен затрагиваться цитохром Р-450. Для этой цели авторами метода была предложена восстанавливающая смесь аскорбата и феназинэтасульфата (или метасу
добавляли
в обе кюветы до конечных концентраций 250
льфата), которую
и 2,5 мкМ соответственно. В результате этой процедуры восстанавливался метгемоглобин, не изменялось состояние цитохрома Р-450, хотя частично редуцировался цитохром b
. Моно-
5
оксигеназные активности у рыб определяются аналогично крысиным.
Необходимо отметить, что если в свежевыделенных микросомах печени теплокровных животных цитохром Р-420 практически отсутствует, то в микросомах печени рыб он все-таки
обнаруживался, несмотря на все меры предосторожности, предпринимаемые при выделении. Возможно, что эта неактивная
форма цитохрома Р-450 присутствует в печени рыб in vivo и соответствует естественному у
ровню катаболизма гемопротеида.
181
5. Методики гидроксилазной активности изоформ
цитохрома Р-450 в микросомной фракции печени рыб
5.1. Во время эксперимента рыба содержалась в проточ-
ных аквариумах при температуре воды 12-14°С. Эксперимен-
тальной работе предшествовала 2-недельная адаптация рыб.
В каждой из экспериментальных групп использовали рыб одного возраста (2-3 года) и пола (самцы).
Прудовых карпов (Cyprinus carpio) из рыбхозяйства привозили на биологический ф-тет МГУ в аэриру
(~ на 40
л) с прудовой водой, проводили температурную адап-
бидонах
мых
тацию и помещали в аквариум с водой без протока (при комнатной температуре), находящийся в специальной лабораторной комнате. Рыбам периодически меняли воду, сливая старую
и заливая свежей водой 2/3 аквариума. Карпы, как и байкальские рыбы, проходили 2-х недельную адаптацию перед использованием в экспериментах.
5.2. Ксенобиотики вводили рыбам (в расчете на 1 кг массы тела) одноразовой инъекций в растительном масле в следующих концентрациях: МХ – 20 мг/кг, АХ – 200 мг/кг.
5.3. Микросомну
описанному выше методу через 7 су
БП-гидроксилазную активность измеряли
ю фракцию выделяли из
т после инъекций.
по методу Неберта
печени рыб по
(Nebert and Gelboin, 1968). Для определения арил-гидро-
ксилазной активности использовали среду, содержащую 50 мМ
Трис-HCl буфер, рН 7,5; 0,36 мМ НАДФН, 3 мМ MgCl
, 0,1-
2
0,8 мг микросом печени рыб (по белку) и 80 мкМ БП (внесен-
ного в 0,04 мл метанола перед инкубацией). Смесь перемешивали в течение 30 мин при 25˚С, реакцию останавливали 1 мл
холодного ацетона. После добавления ацетона вносили 3,25 мл
гексана и смесь инкубировали 10 мин при 25°С. 1 мл образца из
3,3 мл органической фазы экстрагировали 3,0 мл 1N NaOH.
Концентрацию экстрагированного гидроксилированного БП
в щелочной фазе определяли флюориметрически при λ
396 нм, а λ
= 522 нм. В качестве стандарта использовали рас-
исп
возб
182
твор 3-гидрокси-БП. За 1 ед. активности БП-гидроксилазы принимали количество продукта гидролизованного БП, образованного за 30 мин инкубации и флюоресценция которого была эквивалентна флюоресценции 1мкМ 3-гидрокси-БП.
5.4. Активность О-деалкилирования 7-ЭК и 7-ЭР определяли прямым флюориметрическим методом (Methods in
Enzymology, 1978; Klotz et al., 1984), как и в микросомной
фракции печени крыс.
5.5. Иммунохимический анализ изоформ цитохрома Р-450
в микросомной фракции печени рыб проводили с помощью
антител к цитохромам CYT1A1 и CYT2B1 микросом печени
крыс. Выделение очищенных цитохромов из микросом печени
крыс и получение антител описаны ранее (Гу
ляева и др., 1985).
Ингибиторный анализ с помощью специфических антител проводили после предварительной инкубации
микросом с антите-
лами при 25°С в течение 5 мин по методу, предложенному для
анализа изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс
(Гуляева и др., 1985). В
качестве контроля использовали неспе-
цифические к цитохрому Р-450 кроличьи антитела. Реакцию
двойной иммунодиффузии проводили по методу Оухтерлони
(Thomas et al., 1981).
6. Процедура выделения изолированной фракции клеток
печени крыс
В опытах использовали интактных беспородных белых
крыс массой 150-180 г. Гепатоциты выделяли по описанному
в литературе методу (Van de Werve, 1980) с некоторыми модификациями. Для получения клеток использовали раствор Тироде следующего состава (мМ): 125,0 NaCl, 3,0 КС1, 1,0 MgCl2,
1,2 NaH2PO4, 2,0 СаСl2, 40 трис (рН 7,4); температура 37°С.
Брюшную полость наркотизированного (медицинским
эфиром∗) животного вскрывали и в нижнюю полую вену или
∗
Тип наркоза (при соблюдении всех остальных процедур) не влияет на
количество и качество выделенных клеток (Krebs et al., 1974), главное,
чтобы наркоз не был излишне глубоким.
183
брызжейку тонкого кишечника вводили гепарин (500 ед./мл),
подводили лигатуры под v. portae, захватывая a. hepatica
propria и под v. cavae inf., выше v. renalis dextra. Через 1 мин
после введения гепарина надсекали v. portae в мезенхемальной
части и немедленно ее канюлировали. Канюлю укрепляли зажимом дистальнее 1-й бифуркации v. portae и сразу же надсекали v. cava inf., чтобы избежать набухания печени. Затем канюлю фиксировали двумя лигатурами. В v. cavae inf. вставляли
капилляр диаметром 1,7 мм. После этого вскрывали диафрагму,
под v. cava sup. подводили лигатуру, которую перевязывали
или вставляли в нее канюлю.
Перфузию печени осуществляли in situ раствором Тироде
без ионов кальция и с добавкой 0,5 мМ ЭГТА, перфузат газировали карбогеном (О2+СО2, 95:5). Бескальциевый раствор пропускали со скоростью 15-20 мл/мин. Скорость потока не должна была превышать эту величину, так как бóльшая скорость
способствует патологическому набуханию печени и разрушению клеток, особенно в бескальциевой среде. Время перфузии
бескальциевой средой (200-300 мл) составляло 7-8 мин. После
этой процедуры печень экстирпировали, и рециркулирующую
перфузию проводили раствором, содержавшим кальций и 0,3%
коллагеназу («Sigma», США), в специальной перфузионной
камере, т.е. в условиях in vitro. Стабильность скорости потока
перфузата имела очень большое значение для обеспечения равномерного снабжения всех участков печени коллагеназой. Оптимальный режим подачи перфузата обеспечивался при скорости 25-35 мл/мин и давлении 10-20 мм водяного столба. Через
3-5 мин после перфузии печени раствором коллагеназы поверхность печени приобретала специфический вид: становилась
заметной сетчатая микроструктура ткани. При мягком надавливании кончиком пластиковой трубки на поверхность печени
можно было видеть медленно исчезающий след. Еще спустя 47 мин в результате такого надавливания появлялось рваное отверстие, из которого происходило вытекание перфузата, что
говорило о завершении диспергирования ткани печени.
После диспергирования первичную клеточную суспензию
дважды фильтровали, используя нейлоновые фильтры с ячей-
184
ками диаметром 100-150 мкм для первой и 61-65 мкм для второй фильтрации. Затем фильтрат очищали от поврежденных
фрагментов, агрегатов и непаренхиматозных клеток путем
трехкратного центрифугирования (100g, 1-2 мин) в растворе
Тироде, содержавшем 1,5% очищенного от жирных кислот альбумина
∗∗
, и получали суспензию очищенных гепатоцитов. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева с трипановым
синим для оценки жизнеспособных гепатоцитов.
7. Методы выделения нейтрофилов из крови крыс.
Оценка функциональной активности нейтрофилов
(развитие ОВ) и их монооксигеназной системы.
Методы хемилюминесценции и ЭПР
Использовали нейтрофилы, выделенные из гепаринизированной артериальной крови брюшной аорты крыс. Впоследствии уто
чня
ли методические разработки в направлении усовершенствования этой тест-системы вплоть до исследования определенных параметров на образцах цельной неразведенной крови как животных, так и человека. Изучали влияние на белых
беспородных крыс (массой до 300 г) внутрибрюшинного введения СВ и МХ (200 и 40 мг/кг массы соответственно) на активность нейтрофилов их крови. Введение этих ксенобиотиков
в растворе растительного масла было однократным, и после их
действия в течение 48 ч крыс забивали. За су
вотных
лишали пищи.
тки до забоя жи-
Нейтрофилы выделяли по модифицированному методу
(Boyum, 1968), используя солевую среду выделения (измерения) следующего состава (мМ): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl
∗∗
Добавление альбумина способствует высокому уровню дыхания гепатоцитов, защищает их от агрегации, стабилизирует клеточную мембрану,
создает необходимое осмотическое давление, предохраняет мембранные
белки, связывает жирные кислоты и билирубин, снижает чрезмерную
биосинтетическую активность изолированных клеток, приближая их
к состоянию in vivo («Гепатоцит. Функционально-метаболические свойства», 1985).
2,
185
1 CaCl2, 1 Na2HPO4, 5 глюкозы, 10 HEPES – 5 трис-буфера
(pH 7,4). К 10 мл полученной крови добавляли 1 мл 5% декст-
рана в физиологическом растворе и затем инкубировали в течение 45 мин при +4°С. После осаждения крови в этих условиях
осторожно отбирали 3 мл вытяжки плазмы с декстраном и наслаивали на 1 мл фиколл-пака.
Получившийся градиент центрифугировали при 400 g
в течение 20 мин, затем осторожно пипеткой отбирали слой
нейтрофилов между плазмой и раствором фиколл-пака, оставляя в нижней части пробирки соосевшие другие лейкоциты
и эрироциты, и переосаждали нейтрофилы в среде выделения
при 200 g. Отмывали осадок не менее двух раз средой выделения, центрифугируя су
спензии при 200 g. Если
после первого
осаждения нейтрофилов обнаруживали соосевшую с ними неседиментировавшу
вергали осмотическому шоку: добавляли 0,85 мл воды на 20
ю ранее часть эритроцитов, этот осадок под-
с,
а затем быстро вводили 0,15 мл 1 М раствора NaCl (до концентрации 150 мМ или 0,9%, т.е. физраствора) и центрифугировали. Конечную суспензию нейтрофилов готовили путем ресуспендирования осадка в 100 мкл среды выделения. Число клеток
подсчитывали в камере Горяева с 5% трипановым синим для
оценки жизнеспособности нейтрофилов. Она была не ниже 98%.
Для определения интенсивности ОВ нейтрофилов использовали люминометр ПХЛ-01. В среду измерения (1,5 мл) вносили
люминол (ЛМ) (10
-4
М), нейтрофилы (0,5 • 105 клеток/мл), регист-
рировали интенсивность ХЛ при 37°С после добавления активатора ОВ ФМА, 10
выражали в относительных единицах люминесценции на 10
-7
М. Интенсивность ХЛ в максимуме кривой
6
кле-
ток.
8. Условия индукции ПОЛ в различных системах
8.1. После темновой или световой инкубации, в том числе
после индукции ПОЛ, из сетчаток или НС при тусклом красном
свете (а также из всех исследуемых тканевых, клеточных
186
и мембранных исследуемых систем) смесью хлороформ – метанол (2:1) извлекали липиды (при 2-4 °C) по методу (Folch et al.,
1951). Выделенные фосфолипиды осаждали при 27000 g в течение 15 мин. Экстракцию липидов проводили из расчета на
1 г 20 мл смеси Фолча при гомогенизировании в течение
3 мин в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком.
Гомогенаты фильтровали и разделяли в делительных воронках
с добавлением 1/7 части воды. К водной су
вали смесь Фолча так, чтобы водная
спензии НС прили-
фаза составляла
1/7 от общего объема. После гомогенизирования происходило
разделение смеси в делительных воронках. Для предотвращения окисления липидов в каждую воронку добавляли твердую
углекислоту, ионол из расчета 1 мг на 100 мл раствора, продували инертными газами. Для анализа использовали хлороформную фракцию липидов, полученную после трехкратного разделения, хлороформ уда
ля
ли на пленочном испарителе и получали «сухие» липиды (например, 3-4 мг в каждой пробе из сетчаток; 1-3 мг – из НС). Хранение липидов происходило на сухом
льду (-70˚С).
8.2. Для индукции ПОЛ к субстратам (ЖК эмульсиям,
различным мембранам, клеточным су
добавляли (NН
•FеSО4 или FеSО4•6Н2О (3•10
4)2SО4
спензиям и тканям и т
-6 – 10-5
а также соответственно HАДН, НАДФН или аскорбат (2-5•10
.
д)
М),
-4
М)
и проводили инкубации в аэробных условиях (постоянное перемешивание) в среде, содержащей 100 мМ NaCl, 50 мМ трисНCl (фосфатного) буфера (рН 7,2), при температуре 37°С в течение 15, 30, 45 или 60 мин. Процесс ПОЛ in vitro останавливали ЭДТА (10
или 4-метил-2,6 дитретбутил фенолом (ионолом) (10
-5
М), связывающим ионы двухвалентного железа,
-4
М), ин-
гибирующим свободно-радикальное окисление.
9. Определение ГП во фракции фосфолипидов
Выделенные общие фракции фосфолипидов подвергали
анализу на определение первичных продуктов свободнорадикального окисления липидов – ГП.
187
9.1. Содержание ГП в полиненасыщенных липидах опреде-
ляли спектрофотометрически по характерному для образующихся диеновых конъюгатов максимуму поглощения в УФ-спектре
липидов (220-350 нм при λ
= 232 нм) (Bolland and Koch, 1945)
макс
в смеси метанол-гептан (5:1). Концентрация липидов, используемая при спектрофотометрии, была 0,2-0,4 мг/мл.
9.2. Общее содержание ГП определяли методом полярографии с ртутно-капельным электродом в системе органических растворителей метанол-бензол (1:1) с добавкой 0,3 М LiCl
(Данилов и др., 1972) на полярографе в герметической электролитической ячейке с продувкой раствора липидов аргоном во
избежание взаимодействия с кислородом воздуха. Механизмом
восстановления ГП на рту
двухэлектронную реакцию, обычно ведущую к разрыву С
тно-капельном электроде считают
-О
связи с образованием ОН-групп:
На полярографе снимали вольт-амперную кривую в диапазоне напряжений на катоде 0,00 ÷ -2,00 Вт. Потенциал восстановления ГП в данной системе растворителей Е
= –
1/2
0,78 ÷ -0,83 Вт. Концентрацию ГП липидов определяли из вы-
ражения С = I
– диффузионный ток; I – кон-
станта диффузионного тока; с – скорость вытекания ртути;
– постоянная капилляра, в на-
шем случае a
= 2,48. Концентрация липидов в растворе при
полярографии обычно составляла 1-3 мг/мл.
10. Определение содержания МДА –
молекулярного продукта ПОЛ
Накопление MДА – молекулярного продукта переокисления липидов – регистрировали по реакции с ТБК спектрофометрически, комбинируя методы (Kohn and Liversedge, 1944;
Bernheim et al., 1948; Ланкин и др., 1975). В результате реакции
МДА с ТБК образуется триметиновый комплекс после сле-
188
дующих процедур. Объекты, подверженные пероксидации, содержавшие 5 мг белка (10
6
клеток), обрабатывали трихлорук-
сусной кислотой (ТХУ): к 1 мл пробы приливали 3 мл 30%
ТХУ, затем смесь центрифугировали в течение 15 мин при
3000 об./мин. Супернатант смешивали с 1мл 0,6% ТБК и 0,5 мл
HCl, нагревали в течение 10 мин при 100°С, охлаждали до ком-
натной температуры и измеряли величину оптической плотности при 535 нм, принимая коэффициент
щегося комплекса Е
в нмоль МДА на мг белка (на 10
=1,56•105 М-1·см-1. Значения выражали
535
6
клеток).
экстинкции образую-
11. Системы генерации АФК
и системы регуляции АФК, ПОЛ
11.1. О НАДН- или НАДФН-зависимой генерации анионрадикала суперокиси в суспензиях НС и ВС палочек судили по
образованию адренохрома (Е
(Misra and Fridovich, 1972). Ингибиторами накопления
•
ОН
были 1,3-дифенилизобензофуран (ДФИБФ, 10
диазобицикло-(2,2,2)-октан (ДАБЦО, 10
и норадреналин (10
нит (5•10
-2
М), комплекс Сu(Туr)2 (10-6 М), которые добавляли
-4
М), этанол (1 М), метанол (5•10-2 М), ман-
= 4020 М-1-см-1) из адреналина
480нм
-5
-4
М), адреналин
1
*
О
, О
2
2
М), 1,4-
•-
,
в среду индукции ПОЛ.
11.2. Двумерную тонкослойную хроматографию липидов
(нативных или подвергавшихся ПОЛ) проводили соответственно
в системах: хлороформ – метанол – 28%-ный аммиак (65 : 35 : 4)
и хлороформ – ацетон – метанол – уксусная кислота – вода
(5:2:1:1 : 0,5) по методу (Vaskovsky and Kostetsky, 1968); одномерную в системе хлороформ – метанол – вода (65:25:4)
(Wagner et al., 1961). Жирнокислотный состав фосфолипидов
ФРМ определяли с помощью газо-жидкостной хроматографии.
11.3. Активность СОД определяли в гомогенатах тканей,
мембранах или в водно-этанольных вытяжках из мембран (после предварительной обработки суспензии мембран смесью
хлороформ – этанол (3 : 5) по описанному методу (Fridovich,
189
1972), используя для генерации анион-радикала суперокиси
систему ксантиноксидаза – ксантин в присутствии тетранитротетразолий синего (НСТ). Пробы составляли следующим образом: в измерительную кювету вносили 50 мМ К-фосфатный
буфер (рН 7,8), содержащий 1% тритон Х-100 (можно без него)
и следующие реагенты: 20 мкл 10 мМ ксантина, 20 мкл 2,5 мМ
НСТ, 20 мкл 10 мМ ЭДТА, 20-100 мкл ксантиноксидазы и 10100 мкл исследу
лял 2
мл. Скорость образования продукта восстановления НСТ
емого образца. Конечный объем пробы состав-
диформазана регистрировали на спектрофотометре при длине
волны 560 нм. Концентрацию ксантиноксидазы подбирали таким образом, чтобы скорость восстановления НСТ в контроле
составляла 0,030-0,035 оптических ед./мин. Кювета сравнения
содержала те же компоненты за исключением ксантиноксидазы. Активность СОД рассчитывали по форму
ле:
2(V
0-Vextr
) n
Х = ––––––––––––,
V
C
0
где V
– скорость восстановления НСТ без добавления
0
образца;
V
скорость восстановления НСТ с исследуемым об-
extr –
разцом;
С – концентрация белка (гемоглобина);
n – совокупное число разбавлений.
11.4. Активность ГПР и ГР определяли по методу (Ланкин
и Гуревич, 1976) с использованием в качестве субстрата пероксидазной реакции ГП трет-бутила. Содержание токоферола
в подвергшихся сапонификации этанол-гексановых (1:4) экстрактах из суспензий мембран определяли после предварительной тонкослойной хроматографии (в системе гексан : диэтиловый эфир : ледяная СН
СООН, 84 : 15 : 1) по характерным
3
спектрам флюоресценции (Taylor at al., 1976).
190
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]