Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
тер модификации липидного бислоя существенно зависит и от
концентрации ЛФ, то ингибирование реакций может либо определяться непосредственным их влиянием на цитохром, либо
проявляться за счет детергентных свойств ЛФ (Weltzien, 1979).
6.2. Сравнительное действие продуктов гидролиза
фосфолипидов фосфолипазой А
на деалкилазную
2
активность изоформ цитохрома Р-450
в микросомах печени крыс и рыб
Активация фосфолипаз является одним из основных фак-
торов модификации липидного состава при адаптации рыб
к условиям окружающей среды. Исследовали доступность липидов микросом печени карпа к действию фосфолипазы А
2
(0,175 е.а. мг-1 белка микросом) в норме и после индукции мо-
нооксигеназ МХ. Параллельно исследовалась инактивация монооксигеназных активностей ЛФ. Индукция in vitro экзогенной
фосфолипазой А
гидролиза фосфолипидов в микросомах рыб
2
существенно отличается от этого процесса в мембранах
ЭР крыс как в норме, так и при индукции монооксигеназ МХ.
Было обнаружено, что гидролиз фософолипидов в микросомах
карпа происходит значительно более интенсивно, чем в микросомах контрольных крыс (табл. 6.2.1). Это может объясняться
присутствием значительно большего количества ПНЖК в составе фосфолипидов ЭР печени рыб.
Несмотря на то, что, как было показано выше, фосфоли-
пидный и жирнокислотный состав микросом печени рыб модифицируется введением МХ, этот процесс практически не влияет
на глубину гидролиза.
Таким образом, присутствие ксенобиотиков в тканях рыб
не только приводит к индукции монооксигеназ, но и стабилизирует мембранную систему ЭР, что, по-видимому, является
одним из факторов биохимической адаптации холоднокровных
организмов к воздействию факторов окру
жающей среды
.
91
Таблица 6.2.1
Гидролиз фосфолипидов микросом печени карпа и крысы
фосфолипазой А
в норме и после индукции монооксигеназ
2
3-метилхолантреном
Продукты гидролиза
фосфолипидов,
мкг• мг
Свободные ЖК ЛФ
-1
белка
Глубина
гидролиза,
%
12,7
15,0
5,0
25,0
Вид
животного
Карп
Карп +
МХ
Крыса
Крыса + МХ
фосфолипидов,
Содержание
-1
мг• мг
белка
0,66 ± 0,07 46,51 ± 2,05 84,04 ± 3,53
0,71 ± 0,06 58,56 ± 0,88 107,08 ± 0.59
0,46 ± 0,03 13,04 ± 1,50 22,62 ± 2,30
0,42 ± 0,02 62,52 ± 1,50 105,55 ± 0,90
Были проведены сравнительные эксперименты по дейст-
вию фосфолипазы А
на гидроксилазную активность микросом
2
печени крыс и карпов. Известно, что продукты гидролиза фосфолипидов существенно влияют на биотрансформацию мутагенных и канцерогенных соединений (Абилев, 1986), а, в свою
очередь, попадание в ткани рыб целого ряда ксенобиотиков
приводит к активации эндогенных фосфолипаз, увеличению
удельного содержания в тканях ЛФ (Сидоров, 1983). Кроме
того, фосфолипазы типа А в целом регу
в мембранах тканей рыб, приводя к изменению плаву
ют состав липидов
лиру
чести
у рыб, что может быть весьма важным в условиях меняющегося
экологического состояния водоема. Мы показали, что в микросомах из печени карпов под действием фосфолипазы А
чете на 1 мг белка образуется в норме 84+
а после воздействия МХ – 107+
0,6 мкг. За это же время в микро-
сомах из печени крыс в норме накапливается 22,6+
3,5 мкг ЛФ за 5 мин,
2,3 мкг ЛФ/мг
белка, а в момент максимальной индукции МХ – 105+
в рас-
2
0,5 мкг
ЛФ/мг белка. При этом активность ЭКОД в расчете на 1 нмоль
цитохрома Р-450 в микросомах печени карпа в норме и при
индукции снижается на 45%, а в неиндуцированных микросомах из печени крыс – на ~50% и на ~70% – в индуцированных
МХ.
92
По-видимому, различия в глубине гидролиза связаны не
только с различием в фосфолипидном составе, но и с особенностями механизмов индукции монооксигеназ и сопряженного
с ней синтеза de novo фосфолипидов в печени, а также в значительной разнице скорости обмена веществ у рыб и крыс. В работе Neas and Hazel (1984) было показано, что наличие в микросомной фракции печени раду
разных форм фосфолипазы А
связано с их ролью поддержания
2
жной
форели
Salmo gairdneri
механизмов температурной адаптации этой рыбы. Фосфолипаза
А
печени форели, адаптированной к теплой воде (20°С), была
2
более активна в гидролизе микросомных липидов, чем у рыб,
акклиматизированных к воде при низкой температуре (5°С).
Холодная вода всегда больше насыщена кислородом, чем теплая, и поэтому кислородзависимые процессы, протекающие
в организме рыб, обитающих в более холодных водоемах (пример тому – оз. Байкал), могут активизироваться (гидроксилазная функция монооксигеназ в том числе). Эти процессы вызывают изменения в активности эндогенных фосфолипаз,
что,
в частности, облегчает рыбам температурную адаптацию при
изменении температуры водоемов. И, наконец, при наличии
в жирнокислотных остатках фосфолипидов гидроперекисных
группировок ускоряется процесс деацилирования и облегчается
возможность репарации фосфолипидов печени крыс с помощью
ацилтрансфераз (Каган и др., 1978; McLean et al., 1993; Nigam
and Schewe, 2000). Этот механизм также может быть существенным в процессе температурной акклиматизации рыб, когда
увеличивается активность цикла деацилирования–реацилирования в мембранах микросом печени (Neas and Hazel, 1984).
Таким образом, роль фосфолипазы А
оказывается важ-
2
ной как в регуляции ферментативной активности монооксигеназной системы печени теплокровных и холоднокровных животных, обусловленной свободно-радикальными процессами
и гидроксилированием различных субстратов, так и в поддержании этих процессов при изменении такого важного фактора окружающей среды, как температура.
93
ГЛАВА VII
СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ
В КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ
7.1. Модель изолированных гепатоцитов
как биологическая тест-система
для оценки устойчивости цитохрома Р-450
Одной из эффективных моделей для изучения роли АФК
на клеточном уровне является культура изолированных первичных гепатоцитов. Наиболее распространенным источником
этих клеток является печень крысы. Однако гепатоциты можно
получать и из печени других млекопитающих, а также рыб
и птиц (Elliott et al.,
уд
овлетворительные методы выделения гепатоцитов, в частно-
1976). Разработаны разные, достаточно
сти, путем механического и химического диспергирования печени (Longmuir and Rees, 1956; Branster and Morton, 1957),
но среди них отдается предпочтение перфузионно-диспергирующему методу, способствующему получению клеток печени, наиболее приближенных по своим свойствам к свойствам
их в составе печени in vivo (Van de Werve J., 1980). На наш
взгляд, за последние 25 лет наиболее полное описание методических процеду
р и функционально-
метаболических свойств
гепатоцитов содержится в коллективной монографии «Гепатоцит. Функционально-метаболические свойства» (1985) под редакцией члена-корреспондента РАМН, проф. Л.Д. Лукьяновой.
В этой монографии большое внимание уделяется кислородному
обмену клеток печени, особым образом акцентируется внимание на немитохондриальном потреблении кислорода, т.е. использовании его клеткой для образования АФК. В этой области
исследований клеток печени накоплен богатый материал, и поэтому модель гепатоцитов в некоторых слу
чаях
может быть
предложена как система для биотестирования, основанная на
94
реакциях АФК. Была предпринята попытка оценить спонтанное
изменение функционального состояния цитохром Р-450зависимой системы гепатоцитов в процессе их инкубации,
а также при активации ПОЛ в них. Результаты этих исследований перекликаются с ранее приведенными в монографии результатами, полученными на мембранной микросомной модели, показывающей определенные взаимоотношения между фенольными продуктами гидроксилирования ксенобиотиков и
проду
ктами
ПОЛ.
Важным местом в процедуре выделения гепатоцитов является сохранение их жизнеспособности, о чем подробно написано в вышеозначенной монографии.
Остановимся на некоторых особенностях, связанных
с неизбежной повреждаемостью хотя бы части гепатоцитов
в процессе их выделения из печени. Повреждения гепатоцитов
могут происходить по различным причинам. Они определяются
индивидуальными особенностями животных и сезонными изменениями, ус
ми выделения гепатоцитов и совокупно-
ловия
стью других моментов, которые бывает трудно оценить. В свежевыделенных гепатоцитах практически всегда можно регистрировать ту или иную степень пероксидации их мембранных
липидных компонентов. Однако этот первоначальный уровень
продуктов ПОЛ может заметно варьировать от выделения
к выделению и, по-видимому, не всегда связан со степенью
повреждения клеток, а зависит от причин, вызвавших его. Нами
было показано, что количество свежевыделенных гепатоцитов
с нарушенной проницаемостью плазматической мембраны
(% прокрашенных трипановым синим клеток) не коррелиру
с начальным уровнем окисленности
липидов, оцененным по
ет
содержанию МДА (табл. 7.1.1).
Тест-система, основанная на модели гепатоцитов, является более нативной, чем модель изолированной микросомной
системы, в некоторых слу
чаях
глубже выявляет последствия
активации кислорода в результате, например, воздействия канцерогенных ксенобитиков, лекарственных средств, промышленных выбросов и т.д. Мы разработали некоторые подходы,
95
позволяющие одновременно оценивать деструктивные процессы в этих клетках, связанные с активацией кислорода и реакций
ПОЛ, а также процессы репарации, происходящие в присутствии ряда антиоксидантов, прежде всего затрагивающие систему
детоксикации ксенобиотиков – цитохром Р-450-зависимую монооксигеназную систему печени.
Таблица 7.1.1
Содержание МДА и цитохрома Р-450
в свежевыделенных гепатоцитах
в нулевой момент времени их инкубации,
нмоль/10
6
клеток (r = -0,15)
Число
непрокрашенных
клеток, %
20 0,14 0,2
30 0,31 0,08
50 0,04 0,135
70 0,12 0,08
100 0,3 0,048
Содержание МДА
Содержание
цитохрома Р-450
Мы использовали модель гепатоцитов из печени крыс,
хотя, на наш взгляд, полученные нами результаты приложимы
и к процессам, происходящим в клетках печени других видов
животных, например, в гепатоцитах рыб. Последняя модель
в настоящее время широко используется, например, в исследованиях по влиянию ксенобиотиков ряда ПАУ на индукцию специфических форм цитохрома Р-450 в гепатоцитах форели
(Scholz and Segner, 1999; Segner and Cravedi, 2001).
7.1.1. Механизмы деструкции цитохром Р-450-зависимой
детоксицирующей системы в гепатоцитах
Уже достаточно хорошо ус
влено, что накопление
тано
продуктов ПОЛ в мембранах ЭР печени in vivo сопровождается
общим снижением активности системы оксигеназ со смешан-
96
ной функцией и деградацией ее терминального компонента
цитохрома Р-450. Наблюдается достоверная обратная корреляция (r = – 0,81) между содержанием цитохрома Р-450 и концентрацией продуктов ПОЛ в микросомной фракции печени животных как в нормальных физиологических условиях, так и при различных патологиях (Е-авитаминоз, ишемия и др.), а также при
индукции системы монооксигеназ различными ксенобиотиками
(Com
porti and Benedetti, 1972;
Велиханова и др., 1981 и т.д.).
На модели изолированных клеток печени можно исследовать закономерности индукции процесса ПОЛ, зависимость
этого процесса от природы индукторов или ингибиторов, целостности гепатоцитов, а также изучать те изменения, которые
являются результатом прямого или опосредованного воздействия на клетки печени образующихся продуктов ПОЛ.
Была проведена серия экспериментов, затрагивающих выяснение условий устойчивости цитохром Р-450-
зависимой монооксигеназной системы в гепатоцитах. Представлялось важным установить, в частности, в какой мере НАДФН-зависимое
ПОЛ является механизмом спонтанной деградации системы
оксигеназ со смешанной функцией, постоянно наблюдаемой
в первые часы после изолирования гепатоцитов. Из табл. 7.1.1
видно, что соотношения исходного содержания цитохрома
Р-450 и проду
у разных
ктов ПОЛ в свежевыделенных гепатоцитах крыс
индивидуумов не коррелируют между собой. Однако
в культуре гепатоцитов одного и того же выделения в процессе
инкубации суспензии клеток, как мы показали, происходило
спонтанное накопление МДА и обусловливало спонтанную
деструкцию цитохрома Р-450 с высоким коэффициентом обратной корреляции (r = –
0,98) (рис. 7.1.1,
кривые 3,4). В литературе есть лишь единичные указания на то, что деградация
цитохрома Р-450 в клетках печени коррелирует с образованием
продуктов ПОЛ (Högberg et al., 1975).
В случае инкубации гепатоцитов в среде, содержащей
2+
систему инициирования ПОЛ (Fe
-АДФ+НАДФН), такая кор-
реляция сохранялась (r = – 0,97) (рис. 7.1.1, кривые 1,2), но
97
в присутствии этой системы накопление МДА в первые 30 мин
происходило приблизительно в 25 раз быстрее, чем в отсутствие инициаторов (1,81+
0,80 против 0,07+0,02 нмоля МДА
на 1 мг белка соответственно).
Рис. 7.1.1. Динамика деградации цитохрома Р-450 (2,4)
и изменение накопления МДА (1,3) в изолированных
гепатоцитах крысы: 1,2 – в присутствии ситемы
индукции ПОЛ Fe
3,4 – спонтанные деградации Р-450 и накопление МДА
при инкубации гепатоцитов. Исходное содержание
цитохрома Р-450 (МДА) принято за 100%
2+
– АДФ (5•10-5 М) + НАДФН (10-4 М);
Обращает на себя внимание также более низкая скорость
спонтанной деградации цитохрома Р-450 в гепатоцитах
(0,007+
при индуцированном ПОЛ (0,015+
0,001 нмоль на 1 мг белка) по сравнению с деградацией
0,002 нмоль на мг белка)
и в то же время значительно менее интенсивное накопление
продуктов ПОЛ (рис. 7.1.1). Тот факт, что при индуцированном
ПОЛ в суспензии гепатоцитов резко интенсифицируется накопление вторичных молекулярных продуктов диальдегидной природы типа МДА (в 25 раз выше по сравнению со спонтанным
ПОЛ), но деструкция цитохрома Р-450 не у
98
величивается столь
значительно (всего в 2 раза), говорит в пользу триггерного механизма ПОЛ в разборке цитохрома Р-450: не вся мощность
процесса ПОЛ используется в этом случае.
С другой стороны, спонтанно развивающаяся индукция
ПОЛ в гепатоцитах в процессе их инкубации не обязательно
связана с НАДФН-зависимой его инициацией в ЭР клеток, как
это имеет место в присутствии Fe
2+
-АДФ+НАДФН (см., напри-
мер, табл. 7.1.1. и пояснения к ней).
7.1.2. Антиоксиданты как стабилизаторы
цитохрома Р-450 в гепатоцитах
Дополнительные доказательства связи деградации цитохрома Р-450 с активацией ПОЛ в модели первичной культуры
гепатоцитов были получены нами при исследовании действия
ингибиторов свободно-радикального окисления липидов на
деструкцию цитохрома Р-450 в изолированных гепатоцитах
крысы.
В качестве возможного стабилизатора цитохрома Р-450 использовали широко применяемый жирорастворимый антиоксидант ионол в концентрации 10
-4
М. При инкубации гепатоцитов
в присутствии ионола накопления МДА в течение 60 мин
не происходило ни в случае индукции ПОЛ системой
2+
Fe
-АДФ+НАДФН, ни при отсутствии этой системы, а содержание цитохрома Р-450 оставалось на первоначальном уровне
(рис. 7.1.2.1, табл. 7.1.2.1). Другой антиоксидант фенол пирогаллол в концентрации 10
-4
М также способствовал ингибированию
накопления МДА в суспензии гепатоцитов и стабилизации цитохрома Р-450 в них, однако он обладал менее выраженным стабилизирующим действием, чем ионол (см. табл. 7.1.2.1). Различие
в действии этих двух веществ можно объяснить следующим образом. Ионол обладает отличными от пирогаллола стереоэлектронными свойствами, которые важны для проявления антиоксидантных свойств фенолов (Messerle and Curtis, 1980).
Кроме того, ионол гидрофобен способен проникать
в биомембраны, становясь ловушкой для алкильных радикалов.
99
В отличие от этого пирогаллол является гидрофильным
фенолом, способным перехватывать гидроксильные или перекисные радикалы.
Рис. 7.1.2.1. Спонтанная деградация цитохрома Р-450 (1)
и изменение накопления МДА (2) в изолированных гепатоцитах.
Защитное действие ионола (10
гепатоцитов на содержание цитохрома Р-450 (3) и МДА (4).
Исходное содержание принято за 100%
-4
М) после 60 мин инкубации
Мы уже рассматривали возможность фенолов ингибировать НАДФН-зависимое ПОЛ мембран микросом байкальских
рыб. Это указывает на универсальность действия антиоксидантов фенольной природы на развитие процесса ПОЛ как в микросомной системе печени разных видов животных, так и на
модели изолированных гепатоцитов. Поэтому обе рассматриваемые модели – мембранная и клеточная – могут быть предложены не только для тестирования загрязнителей – индукторов монооксигеназной системы и активаторов ПОЛ, но и как
тест-системы для проверки антиоксидантной способности ксенобиотиков фенольной природы.
100
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]