Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
вается скорость последующей деградации Р-450 при накоплении эндогенных продуктов ПОЛ (см. табл. 3.3.1). Таким образом, реакции ПОЛ и действие протеаз – два взаимоусиливающихся процесса, в совокупности резко повышающих скорость
деградации пулов цитохрома Р-450 и доступность их для разборки. Процесс ПОЛ может рассматриваться как триггерный
механизм, делающий доступными те или иные формы цитохрома Р-450 для эндогенных протеаз. Кроме того, в ус
ловия
х
образования перекисей липидов мембранносвязанные ферменты, к группе которых относятся и семейства цитохрома Р-450,
могут инактивироваться благодаря потери их гидрофобного
окружения. При этом становится возможной атака SH-групп,
групп гема окисляющими агентами, в том числе АФК. Понятно,
что реальный механизм разборки микросомных цитохромов
должен иметь в своей основе возможность эффективного протеолиза апоферментной части. Важным механизмом инактивации ферментов может быть способность диальдегидов – продуктов ПОЛ, таких, как МДА, «сшивать» белки. Степень инактивации НАДФН-цитохром Р-450 реду
росомах во времени коррелиру
ет с образованием МДА (Wills,
1971). Важность выяснения условий, при которых
ктазной системы в мик-
может нарушаться стабильность такой функционально значимой системы
организма, как детоксицирующая монооксигеназная система
печени, очевидна. С одной стороны, мы только что рассмотрели
возможные механизмы «разборки» компонентов (прежде всего
цитохрома Р-450) этой системы после актов индукции цитохрома Р-450 и гидроксилирования ксенобиотиков, таких, как
МХ и ФБ. Мы показали, что, как было обнару
жено и другими
авторами, устойчивость конститутивного пула цитохрома Р-450
к таким воздействиям, как ПОЛ и протеолиз, заметно выше,
чем индуцированных форм пула этой терминальной оксигеназы.
Участие перекисей липидов в регуляции
активности монооксигеназных систем в мембранах ЭР in vivo, вероятно,
не ограничивается их ролью в «разборке» индуцированных
мембран. Наличие обратной корреляции между содержанием
цитохрома Р-450 и стационарными концентрациями перекисей
61
липидов характерно для целого ряда других случаев. Анализ
литературных данных показывает, что возможно выявлять обратную корреляцию (r = -0,81) между содержанием цитохрома
Р-450 и эндогенных перекисей липидов в мембранах микросомной фракции печени при различных экспериментальных патологиях. Таких, например, как Е-авитаминоз, лучевая болезнь,
злокачественный рост, ишемия, токсическое действие СCl
4
(Comporti and Benedetti, 1972; Reknagel and Glende, Jr., 1974;
Велиханова и др., 1981; Ахалая и др., 1990).
Изменения доступности цитохрома Р-450
для протеолитической деградации,
вызванные НАДФН-зависимым ПОЛ в микросомах печени
Доступность цитохрома Р-450
Вариант опыта
Трипсин, 10-6 М
Нативные микросомы 54+2 71+7
для протеолиза, % деградации
Трипсин, 2•10
Таблица 3.3.2
-6
М
Микросомы после действия:
ФБ
МХ
Примечание: время протеолиза 5 мин.
61+
52+
2
5
94+
100+
3,5
6,2
Следует специально отметить, что физиологически важная роль процессов ПОЛ в разборке мембранных структур характерна не только для мембран ЭР печени. В тот же период,
в который проводились наши исследования, была также показана необходимость перекисного окисления фосфолипидов, катализируемого липоксигеназой, для эритропоэза: превращение
ретикулоцитов в их зрелые формы, эритроциты (Schewe et al.,
1975; Halangk et al., 1977). При этом ПОЛ высту
триггерного
механизма, обеспечивающего полную разборку
ает в качестве
п
внутриклеточных мембранных структур ретикулоцита.
Заключая этот раздел, надо обратить внимание на следующее. Мы убедились, что необходима тонкая согласован-
62
ность эндогенных и экзогенных факторов, обусловливающих
надежность работы системы монооксигеназ. Установленная
последовательность реализации функционального ответа ферментного ансамбля ЭР гепатоцитов на воздействия факторов
окружащей среды имеет важное значение для поддержания
нормального гомеостаза организма. Каждая особь какой-либо
популяции животных, являющаяся экологической единицей
(Федоров и Гильманов, 1980; Одум, 1986), в случае нарушения
устойчивости таких важных систем, как детоксицирующая система печени, либо выживает в своей экологической нише
за счет мобилизации ресу
же рассматривать человека
рсов организма, либо погибает. Если
, с одной стороны, находящегося
в определенных экологических отношениях в окружающей его
среде, а с другой стороны, являющегося социальным существом, то при изменении его физиологического состояния или
при возникновении какой-либо патологии наряду с мобилизацией собственных ресу
рсов организма, часто требуется вмешательство медицины и применение лекарственных препаратов.
Большинство из последних непосредственно всту
пает в метаболические отношения с системой детоксикации печени организма человека. Нередко действующим лечебным началом являются их продукты, образующиеся в результате реакций гидроксилирования лекарств в монооксигеназной системе, и АФК
в этих реакциях играют основну
ув
еренно можно считать действующими факторами окружаю-
ю роль. Поэтому лекарства
щей среды по отношению к больному человеку. Понимание
механизмов лечебного действия их, модифифицированных
в детоксицирующей системе печени продуктов, представляется
важной задачей. С другой стороны, выявление механизмов лечебного эффекта непосредственно самих медикаментозных
препаратов, не являющихся су
системы, тоже
важно и для пациента, и для врача.
бстратами монооксигеназной
Исходя из вышеизложенного, участие АФК в реакциях
гидроксилирования гидрофобных субстратов может быть также
прослежено на примере скрининга некоторых лекарственных
средств в тест-системе микросомной фракции печени, чему
посвящена следующая глава.
63
ГЛАВА IV
АНТИОКИСЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ
НЕКОТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
В МИКРОСОМНОЙ СИСТЕМЕ ПЕЧЕНИ КРЫС
Большинство лекарственных средств, являющихся по
своей природе чужеродными животному организму веществами, метаболизируется с участием монооксигеназной системы
печени и других органов. В этих процессах лекарства служат
субстратами разных форм цитохрома Р-450. В результате метаболизма ряда лекарственных веществ образуются продукты
реакций, относящиеся к антиоксидантам, например, фенольные
производные (Becket et al., 1971). Такой путь превращений
в монооксигеназной системе типичен, как известно, для нейролептиков фенотиазинового ряда. Так, 7-ОН- и 8-ОН-производные аминазина в силу своих антиоксидантных свойств могут
оказывать медикаментозное действие (Елу
ашвили и др., 1978).
С другой стороны, при попадании в организм ксенобиотиков
(в том числе лекарств) (Litterst et al., 1977; Ляхович и Цырлов,
1981) система монооксигеназ
приобретает важную особенность
в индукции своих структур и последующей их разборке.
Вещества, в процессе метаболизма которых в монооксигеназной системе образуются антиоксиданты, назовем условно
метаболическими антиоксидантами. В отличие от них некоторые ксенобиотики сразу проявляют антиокислительную активность – антиоксиданты прямого действия.
Учитывая также, что накопление проду
развития ряда патологий достоверно обу
ктов ПОЛ в ходе
словливает разрушение
цитохрома Р-450, а ингибирующая ПОЛ способность лекарств
является важным фактором при профилактике или лечении подобных патологий, применение микросомной модели как тестсистемы для проверки этой способности у лекарств вполне оправданно.
64
Мы проверяли антиокислительное действие диэтилкарбамазина (ДЭКП), левамисола, дипиридамола (ДП) и лобензарита
(ЛБ) в различных моделях микросомного ПОЛ. Эту работу
проводили в 1988 году в рамках межвузовского сотрудничества
между МГУ и Национальным центром научных исследований
Кубы в его биомедицинском отделе (тогда зав. отделом был
проф. К.Паскуаль).
Остановимся на краткой характеристике испытывавшихся
лекарств: 1) 1-диэтил-карбамил-4-метилпиперазин (ДЭКП) –
противогельминтное средство, также используемое против филлярий (Wuchereria
Parrat, 1976),
bancrofti, Brugia malagi, Loa Loa) (Abaitey and
которое, кроме того, ингибирует биосинтез лейкотриенов, являющихся продуктами перекисного окисления арахидоновой кислоты липоксигеназой (Joseph and Dixon, 1984; Ford-
Hutchinson, 1985), и вовлекается в патогенез бронхиальной астмы
(Abaitey and Parrat, 1976; Ford-Hutchinson, 1985); 2) (-)2,3,5,6-
тетрагидро-6-фенилмидазо-2,1-6-тиазола гидрохлорид (левамисол) – хорошо известный иммуномодулятор и противогельминтный препарат (Janssen, 1976; Renoux, 1980); 3) 2,6-бис,бис(β-гидроксиэтил)-амино-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо(5,4), или
ДП – антитромботическое средство
remoli and Colli, 1988),
(T
ингибирует синтез лейкотриенов и является антиоксидантом
(Morisaki et al., 1982; Ruggiero et al., 2000); 4) N-(2-карбо-
ксифенил)-4-хлорантраниловой кислоты натриевая соль (или
ЛБ), синтезированный в Национальном центре научных исследований Кубы, – иммуномодулятор, противоартритное средство, обладает гепатопротекторными свойствами – и являющийся
аналогом применяемого в Японии лекарства (Shiokawa, 1985).
Как оказалось, все исследованные медикаментозные средства проявляли в разной степени антиоксидантну
в микросомных моделях ПОЛ и обладали
различными меха-
ю активность
низмами действия. Была предпринята попытка выяснения механизмов ингибирования микросомного ПОЛ, в том числе при
вовлечении
этих лекарств в окислительный метаболизм в монооксигеназной системе, и предотвращения гепатотоксического
действия ССl
как in vivo, так и in vitro.
4
65
Мы индуцировали генерацию АФК в системе микросомы –
2+
(Fe
-АДФ)-НАДФН, что приводило к активации процесса ПОЛ
(следили по накоплению МДА) (рис. 4.1), который полностью
ингибировался в присутствии ДП. Это производное пиримидина с четырьмя гидроксиэтильными группами является антиоксидантом прямого действия, перехватывающим как АФК, так
и перекисные свободные радикалы. Левамисол и ЛБ оказались
слабыми антиоксидантами, достоверно не снижающими уровень накопления МДА в течение 1 ч. Наибольший интерес из
исследованных лекарств вызвал ДЭКП. До сих пор механизм
его действия не был изучен достаточно глу
. В молекуле
боко
ДЭКП содержатся две этильные группы карбамила (1-е положение пиперазинового кольца) и одна связанная с атомом азота
метильная группа (4-е положение кольца), т.е. это вещество
может быть су
по деалкилазному типу с образованием ОН-
бстратом цитохрома Р-450 и метаболизироваться
группы, что опре-
деляет антиоксидантные свойства производного ДЭКП.
Обращает на себя внимание тот факт, что если в первые
30 мин в присутствии ДЭКП происходит резкое снижение скорости накопления МДА, но его количество все же растет, то
в последу
ющие 30
мин инкубации образование этого продукта
заметно тормозится как по скорости, так и по количеству
(рис. 4.1, кривая 2). Можно предположить, что в результате
взаимодействия с монооксигеназной системой ДЭКП включается в метаболизм, и продукты деалкилирования ДЭКП, обладающие антиоксидантными свойствами, предотвращают развитие процесса ПОЛ.
Для того чтобы доказать это положение, была использована система преимущественного метаболизма су
(микросомы, НАДФН и ДЭКП), в котору
бации добавляли Fe
2+
-АДФ для индукции ПОЛ. Как видно на
ю через 30 мин инку-
бстратов
рис. 4.2, в то время как в системе без ДЭКП и в его присутствии
происходит незначительное, практически одинаковое накопление МДА в течение 30 мин инкубации, после добавления
2+
Fe
-АДФ в системе без ДЭКП скорость образования этих про-
дуктов резко возрастает (кривая 1), тогда как в присутствии
66
ДЭКП эта скорость оказалась заметно сниженной (кривая 2).
Это различие указывает на то, что в первые 30 мин могли образовываться достаточные концентрации производных ДЭКПантиокислителей, которые и ингибировали накопление МДА
в последующие 30 мин после добавления в систему индуцирующего ПОЛ фактора – Fe
2+
-АДФ.
Рис. 4.1. Влияние лекарств на накопление МДА
в микросомах печени крыс в присутствии индуцирующих
ПОЛ Fe
1 – ДП; 2 – ДЭКП; 3 – левамисол; 4 – ЛБ; 5 – без лекарств
2+
-АДФ и НАДФН:
В системе без добавления Fe
2+
-АДФ исходно низкий уро-
вень МДА не изменялся в течение всех 60 мин независимо от
присутствия ДЭКП (кривые 3,4), что в этих условиях доказывает резкое снижение скорости генерации АФК, могущих привести к индукции реакций ПОЛ в мембранах микросом печени
крыс.
67
Как было нами показано, в условиях неферментативной
2+
Fe
-аскорбатзависимой индукции ПОЛ в микросомной систе-
ме, когда значительно интенсифицируется этот процесс и не
может происходить метаболизм субстратов цитохрома Р-450,
ДЭКП не ингибирует ПОЛ. Это также подтверждает высказанное выше предположение о «метаболическом» антиоксидантном механизме ДЭКП.
Рис. 4.2. Динамика накопления МДА в микросомах печени крыс
в условиях преимущественного метаболизма ДЭКП:
1 – через 30 мин в присутствии НАДФН и с добавкой Fe
2 – то же, что и 1, в
3 – в присутствии НАДФН без добавки Fe
4 – то же, что и 3, в присутствии ДЭКП
присутствии ДЭКП;
2+
2+
- АДФ;
-АДФ;
Далее сравнивали действие ДП и ДЭКП как самых эффективных из исследованных нами антиоксидантов, но проявляющих антиокислительные свойства по разным механизмам –
по их способности предотвращать в микросомах повреждающее
68
действие ССl4, которое прежде всего выражается в индукции
ПОЛ (Harvey and Klaassen, 1983). В первой серии экспериментов изучали действие ДП и ДЭКП на накопление МДА
in vitro. Результаты опытов по ингибированию процесса ПОЛ,
индуцируемого ССl
ДП так же, как и в случае системы Fe
в присутствии НАДФН, показывают, что
4
2+
-АДФ-НАДФН, эффек-
тивно ингибирует накопление МДА.
ДЭКП также является хорошим ингибитором ПОЛ в этих
условиях, однако, по-видимому, ингибирование отличается от
такового в присутствии Fe
2+
-АДФ.
Рис. 4.3. Динамика накопления МДА в микросомах
печени крыс в присутствии ССl
1 – через 30 мин в присутствии НАДФН и с добавкой ССl
2 – то же, что и 1, в присутствии ДЭКП с 0 мин;
3 – в присутствии ССl
4 – то же, что и 3, в присутствии ДЭКП
НАДФН и ДЭКП:
4,
с 0 мин;
4
;
4
Как видно на рис. 4.3, в системе, преимущественно метаболизирующей субстраты, где могут образовываться антиоксидантные производные ДЭКП, т.е. содержащей микросомы,
69
НАДФН, ДЭКП, добавление через 30 мин инкубации ССl
4
не приводит ни к существенному увеличению скорости накопления продуктов переокисления липидов, ни соответственно
к заметному ингибированию реакции ПОЛ ДЭКП. Этот результат можно объяснить тем, что сам ССl
является субстратом
4
цитохрома Р-450, и в присутствии НАДФН его метаболизм,
идущий по свободно-радикальному пути (McCay et al., 1980),
может, вероятно, конкурировать в свою пользу с деалкилированием ДЭКП. С другой стороны, ДЭКП хорошо предотвращает
накопление МДА, когда ПОЛ в микросомной системе индуцируется только ССl
случае интенсивность ПОЛ ниже, чем в присутствии ССl
(см. рис. 4.3, кривые 3, 4). Однако в этом
4
4
и НАДФН. Объяснить этот результат затруднительно, поскольку в такой системе могут возникать непростые условия взаимодействия на цитохроме Р-450 между ССl
и ДЭКП.
4
Рис. 4.4. Чувствительность микросом печени крыс
к индукции ПОЛ системой Fe
после действия ССl
1 – динамика накопления МДА в контрольных микросомах;
2, 3, 4 – после действия соответственно ССl
+2
-АДФ-НАДФН in vitro
защиты ДЭКП in vivo:
4 и
, ССl4+ДЭКП, ДЭКП
4
70
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]