Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
Мы использовали также в качестве возможного стабилизатора цитохрома Р-450 3-оксипиридин (ОП-6).
Стабилизация цитохрома Р-450
и ингибирование накопления МДА в гепатоцитах крысы
при их инкубации в присутствии системы индукции ПОЛ
антиоксидантами
Таблица 7.1.2.1
Изменения
Условия инкубации
гепатоцитов
В присутствии системы
индукции ПОЛ:
НАДФН(10
(5•10
То же + ионол, 10-4 М 0,002+0,002 0,052+0,020
То же + пирогаллол, 10-4 М 0,0075 0,149+0,073
-4
-5
* Относительно исходного через 60 мин инкубации.
М)+Fe+2-АДФ
М)
в содержании
цитохрома Р-450*,
ΔР-450, нмоль/мг бел-
ка
0,005 1,71+0,44
0,026+
Изменения
в накоплении
МДА*, ΔМДА,
нмоль/мг белка
Известно, что пиридины, в частности ОП-6, обладают
стабилизирующим действием на цитохром Р-450 в культуре
гепатоцитов (Paine and Villa, 1980) за счет взаимодействия
с цитохромом. Мы обнаружили стабилизирующий эффект ОП-6
на цитохром Р-450 в суспензии гепатоцитов при активировании
в них пиридиннуклеотидзависимого ПОЛ. Происходило также
ингибирование этим веществом накопления МДА. Сравнивали
эффект ОП-6 с действием ионола (см. рис. 7.1.2.2).
При спонтанной деградации цитохрома Р-450 в процессе
инкубации гепатоцитов в растворе Тироде с 1,5% очищенного
от жирных кислот БСА в присутствии ОП-6 наблюдали также
замедление деградации Р-450.
Следовательно, стабилизирующее действие пиридинов на
семейство цитохромов Р-450 может быть обу
словлено не только их способностью взаимодействовать с цитохромом, но и их
антиоксидантными свойствами. Следу
отметить, однако, что
ет
101
антиоксидантные свойства у ОП-6 выражены слабее, чем у ионола и пирогаллола, ввиду достаточно высокой гидрофильности ОП-6. Надо сказать, что и 3-оксипиридин, как показано
в работе Paine and Hockin (1980), гораздо слабее стабилизировал цитохром Р-450 в культуре гепатоцитов, чем, например,
другой пиридин – метирапон, хотя, как и метирапон,
3-оксипиридин хорошо связывался с цитохромом. Таким образом, стабильность цитохрома Р-450 в гепатоцитах при действии на них пиридинов зависит как от способности этих веществ взаимодействовать с цитохромом, так и от их антиокислительных свойств.
Рис. 7.1.2.2. Влияние ОП-6 и ионола
на деградацию цитохрома Р-450 (а) и содержание МДА (б)
в изолированных гепатоцитах при индукции в них
НАДФН-зависимого ПОЛ: 1 – контроль;
2 – гепатоциты + Fe
3 – то же + ионол (10
Исходное содержание цитохрома Р-450 и МДА принято за 100%
2+
⎯АДФ (5•10-5 М) + НАДФН (10-4 М);
-4
М); 4 – то же + ОП-6 (10-4 М).
Время инкубации 60 мин.
102
7.1.3. Продукты гидроксилирования БП –
стабилизаторы цитохрома Р-450 в гепатоцитах
Мы показали, что если в среду инкубации гепатоцитов
добавить проканцерогенный ксенобиотик БП, оказалось, что он
защищает цитохром Р-450 от деградации, вызванной активацией ПОЛ (рис. 7.1.3.1). Здесь применяли тот же подход, что
и при исследовании антиокислительной активности лекарственных средств на модели микросом печени крыс и при ингибировании ПОЛ в микросомах печени рыб.
Гепатоциты инкубировали в среде в присутствии БП
и НАДФН, т.е создавали преиму
щественные условия гидроксилирования БП в монооксигеназной системе ЭР. Причем система
активации ПОЛ – Fe2+ ⎯ АДФ либо присутствовала с самого
начала инкубации клеток, либо ее вносили в суспензию гепатоцитов спустя 30 мин.
При этом в первые 30 мин (в присутствии Fe
2+
– АДФ)
(рис. 7.1.3.1, кривая 1; табл. 7.3.1, 1-й столбец, 3-я строка) про-
исходило незначительное снижение скорости деструкции цитохрома Р-450 по сравнению с контролем в отсутствие БП
(табл. 7.1.3.1, 1-й столбец, 1-я строка), а в последующие 30 мин
эта скорость резко снижалась и деградации цитохрома Р-450
практически не происходило (рис. 7.1.3.1, кривая 1).
Одновременно в присутствии БП накапливался МДА
в первые 30 мин со скоростью в 3 раза меньшей (рис. 7.1.3.1,
кривая 2; табл. 7.1.3.1, 3-й столбец, 3-я строка), чем в контроле
(табл. 7.1.3.1, 3-й столбец, 1-я строка), а в последу
ющие 30
мин
накопления МДА не наблюдалось (рис. 7.1.3.1, кривая 2).
Причиной задержки деградации цитохрома Р-450 и уменьшение скорости накопления проду
системе через
30 мин гидроксилирования БП является образо-
ктов ПОЛ в монооксигеназной
вание его продуктов окисления фенольной природы, являющихся антиоксидантами, способными защищать цитохром Р-450
от деструкции.
Доказательством этого положения могут быть результаты
эксперимента, представленные в табл. 7.1.3.1. Одинаковой спо-
103
собности антиоксиданта (фенола пирогаллола) и субстрата оксигеназ БП ингибировать ПОЛ (50% ингибирование накопления МДА по прошествии 1 ч инкубации гепатоцитов) соответствует их одинаковая эффективность как стабилизаторов цитохрома Р-450, что в совокупности с полученными данными
о стабилизирующем действии других антиоксидантов (ионола
и ОП-6) на цитохром Р-450 при индукции ПОЛ в гепатоцитах
свидетельству
о взаимосвязи деградации цитохрома Р-450
ет
с накоплением продуктов ПОЛ в этих клетках.
Рис. 7.1.3.1. Динамика деградации цитохрома Р-450 (1, 3)
и накопления МДА (2, 4) в гепатоцитах в присутствии БП (10
По оси абсцисс – время (в мин), по оси ординат – содержание
(в нмоль на 10
1 – цитохром Р-450 + НАДФН (10
3 – цитохром Р-450 + НАДФН; через 30 мин + Fe
6
клеток) цитохрома Р-450 (слева) и МДА (справа):
2 – МДА + НАДФН + Fe
4 – МДА + НАДФН; через 30 мин + Fe
-4
М) + Fe2+ –АДФ (5•10-5 М);
2+
–АДФ;
2+
–АДФ
2+
–АДФ;
-4
М).
Защитный эффект БП цитохрома Р-450 обусловлен именно антиоксидантными свойствами продуктов его гидроксилирования, а не конкуренцией за источники восстановительных
эквивалентов в НАДФН-зависимой электронтранспортной цепи. Это следует из результатов, представленных на рис. 7.1.3.1.
104
При инкубации гепатоцитов в отсутствие Fe2+–АДФ, но в присутствии НАДФН наблюдали незначительное накопление МДА
в клетках (0,20+
0,11 нмоль на 106 клеток) и соответственно стабилизацию цитохрома Р-450 (рис. 7.1.3.1, кривая 3,4/0-30 мин/).
После добавления в суспензию гепатоцитов Fe
2+
–АДФ в после-
дующие 30 мин не происходило ни накопления МДА, ни деструкции цитохрома Р-450 (рис. 7.1.3.1, кривая 3,4/30-60 мин/).
В суспензии без БП и без Fe
2+
–АДФ, но с НАДФН накопление
МДА в первые 30 мин было таким же, как в системе с добавленным БП, но в последующие 30 мин после добавления Fe
содержание МДА в этих условиях возросло в 1,5 раза.
2+
–АДФ
Таблица 7.1.3.1
Скорость деградации цитохрома Р-450 и накопления МДА
(в нмоль на 10
Условия
опыта
Время
инкубации, мин
Fe2+⎯АДФ +
НАДФН
Fe2+⎯АДФ +
НАДФН +
пирогаллол
-5
М)
(5•10
Fe2+⎯АДФ +
НАДФН +
-4
БП (10
М)
6
клеток за 30 мин) в гепатоцитах крысы (М+m)
Скорость деградации
цитохрома Р-450
0-30 30-60 0-30 30-60
0,001 0,034+0,005 1,300+0,075 0,230+0,120
0,024+
0,004 0,009+0,004 0,500+0,095 0,140+0,095
0,029+
0,038+
0,010 0,006+0,002 0,450+0,170 0,060+0,020
Скорость накопления
МДА
Таким образом, эффективными протекторами цитохрома Р-450 в клетках печени от деструкции, вызываемой процессом ПОЛ, являются антиоксиданты фенольного типа, как экзогенные, так и продукты гидроксилирования, образующиеся
в результате окислительного метаболизма гидрофобных субстратов. Причем, по-видимому, это явление универсально
и присуще монооксигеназной системе печени представителей
разных систематических групп животных.
105
7.2. Функциональный отклик нейтрофилов крови крыс
на воздействие метилхолантрена и совола in vivo
7.2.1. О взаимосвязи активности
иммунокомпетентных клеток с индукцией
монооксигеназной системы ксенобиотиками
Как ясно из представленных выше результатов, система
монооксигеназ является важной составной частью, определяющей химический гомеостаз организма. Она может быть тесно
связана с другой системой защиты организма – иммунной (Ковалев и Полевая, 1985). Монооксигеназная система преимущественно локализована в ЭР гепатоцитов, но присуща и другим
клеткам и тканям, в том числе иммунокомпетентным клеткам
(Головенко и др., 1984; Nisim
В первичных реакциях
oto et al., 1994).
клеточного иммунитета во время
развития воспалительного процесса свои функционально значимые свойства проявляют макрофаги, лейкоциты крови
и, прежде всего, нейтрофилы, как наиболее распространенные
лейкоцитарные клетки. В основе этих свойств лежит активация
ОВ в результате взаимодействия клеток с чу
химическим соединением – активатором (Маянский, 1990;
или
жеродным агентом
Jones, 1993), когда происходит интенсификация генерации
АФК в специализированных ферментных оксидазных системах
иммунокомпетентных клеток крови. Механизм генерации АФК
фагоцитами достаточно хорошо изучен. Одна из первых реакций фагоцитов в ответ на воздействие активатора – это сборка
из неактивных по отдельности компонентов мембранного фермента НАДФН-оксидазы. Этот фермент использует в качестве
су
бстрата восстановленный НАДФН и катализирует реакцию
одноэлектронного
восстановления молекулы кислорода:
+ NADPH Æ 2О
2 O
2
Продукт реакции О
•-
порождает остальные АФК.
2
•-
+ NADP+ + H+.
2
Немаловажен тот факт, что монооксигеназная система
макрофагов и лейкоцитов способна индуцироваться при воз-
106
действии ПАУ и проявлять арилгидроксилазную активность
(Головенко и др., 1984). Известно о влиянии ПХБ на количест-
во лейкоцитов в крови, генерацию супероксиданион радикала
и дегранулирование в нейтрофилах in vivo и in vitro (Ganey et al.,
1993; Wu et al., 1999). Было показано также, что антропогенные
загрязнители являются иммунотоксинами и значительно подавляют хемотаксис нейтрофилов у людей (Governa et al., 1994).
С другой стороны, цитохром Р-450-зависимая система лейкоцитов несет важную функцию в использовании АФК в этих клетках, а именно она отвечает за образование в арахидональном
цикле и гидроксилирование лейкотриенов B
, участвующих
4
в активации НАДФН-оксидазы нейтрофилов, выступая как омега- и омега-4-оксигеназа (CYP4F3) (Sumimoto et al., 1988;
Reynaud et al., 1997; Kikuta et al., 2004).
Однако очевидно, что вопрос о связи активности иммунокомпетентных клеток с индукцией монооксигеназной системы
ксенобиотиками систематически не изучался. Эта проблема
интересна как минимум с двух сторон. Во-первых, если в фагосомальных клетках наличествует цитохром Р-450-зависимая
монооксигеназная система, пусть достаточно специализированная
(Bednar et al., 2000), она, по-видимому, может быть вовле-
чена в метаболизм ксенобиотиков, о
чем говорит ряд работ (Головенко и др., 1984; Trush et al., 1986). Во-вторых, взаимодействие иммунокомпетентных клеток с ксенобиотиками, по-видимому, приводит к метаболизму последних и образованию активных производных, способных конъюгировать с белками
и обладающих антигенными свойствами (Ковалев и Полевая,
1985). Эти причины, по всей видимости, могут изменять фу
циональные возможности АФК-
продуцирующих лейкоцитов.
нк-
Мы изучали, как меняется способность изолированной суспензии нейтрофилов крови крыс, подвергавшихся воздействию МХ
и СВ, к активации ОВ. В данном исследовании использовали
нейтрофилы, выделенные из гепаринизированной артериальной
крови брюшной аорты крыс.
Вначале остановимся на результатах экспериментов, связанных с изучением влияния на белых беспородных крыс (массой до 300 г) внутрибрюшинного введения СВ и МХ (200
107
и 40 мг/кг массы соответственно) на развитие ОВ нейтрофилов
их крови (методом ХЛ). Введение этих ксенобиотиков в растворе растительного масла было однократным, и после их действия в течение 48 ч крыс забивали. За сутки до забоя животных лишали пищи.
В выделенных и очищенных нейтрофилах из крови подверженных действию ксенобиотиков крыс определяли активность
ЭКОД. К су
концентрации
спензии нейтрофилов добавляли 7-ЭК до конечной
1 мМ и реакцию запускали НАДФН (10
-4
М).
Получали скорость накопления продукта деэтилирования
7-ОК, количественные показатели скорости выражали в пмолях
7-ОК на 10
6
нейтрофилов в 1 мин, используя для калибровки
1 мкл 1 мМ раствора 7-ОК (1 нмоль).
Определяли микровязкость наружных мембран нейтрофилов с помощью спинового зонда 5-доксилстеарата (5-ДС)
методом радиоспектроскопии, регистрируя спектр ЭПР встроенного в клеточные мембраны зонд 5-ДС (рис. 7.2.1.1)
1
.
Рис. 7.2.1.1. Спектр ЭПР спинового зонда 5-ДС (50 мкМ)
в присутствии суспензии нейтрофилов
6
клеток, 0,1 мл среды измерения)
(10
1
Авторы благодарят за помощь в этой части работы доцента кафедры
биофизики биологического факультета МГУ К.Н.Тимофеева
108
7.2.2. Влияние ксенобиотиков МХ и СВ на интенсивность ОВ,
активированного в нейтрофилах форбол миристат ацетатом.
Изменение микровязкости мембран нейтрофилов
Известно, что нейтрофилы крови более активны, чем зрелые нейтрофилы костного мозга, а выход в кровяное русло способствует их функциональному дозреванию. Повышенная ХЛ
нейтрофилов крови сопровождает многие заболевания и, повидимому, адекватно отражает степень функционального напряжения гомеостатических механизмов. Факторы, выводящие
нейтрофил на новый у
ровень активности, именуются кондиционирующими (Маянский, 1990). К таким опосредуемым кондиционирование факторам, вероятно, можно относить и ксенобиотики.
В наших экспериментах так и произошло: через 2 сут после воздействия на крыс МХ и СВ в нейтрофилах их крови регистрировали реакцию ОВ нейтрофилов. К этому времени используемые ксенобиотики эффективно индуцировали цитохром
Р-450-зависимую монооксигеназную систему печени (данные
не приводятся). Регистрация ХЛ нейтрофилов показала повышенный у
подверженных
ровень ОВ клеток, выделенных из
крови животных,
действию ксенобиотиков (см. рис. 7.2.2.1).
Можно полагать, что используемые ксенобиотики в процессе двухсуточной индукции монооксигеназной системы, сопровождающейся сдвигом химического гомеостаза организма,
кондиционировали нейтрофилы крыс, причем по у
ровню ХЛ
видно, что проявлялся активирующий эффект кондиционирования. Отличие интенсивности ХЛ нейтрофилов крови крыс
после введения МХ и СВ (рис. 7.2.2.1) может быть связано
с различиями в составе и свойствах этих индукторов. МХ – гидрофобный ПАУ, потенциальный канцероген, иммуномодулятор, вызывающий стойку
тохрома
Р-450 (Burke et al., 1977; Головенко и др., 1984).
ю индукцию определенных форм ци-
СВ – смесь ПХБ, которые могут быть сильными индукто-
рами монооксигеназной системы (Тутельян и др., 1990), а в силу
109
своего гетерогенного состава также являются активными модуляторами химического гомеостаза. Изменение гомеостаза под
влиянием индукции изучаемыми ксенобиотиками, по-видимому, идет различными путями, прежде всего связанными с метаболизмом этих ксенобиотиков и образованием разной степени
токсичности продуктов.
Рис. 7.2.2.1. Интенсивность ОВ нейтрофилов,
полученных из крови крыс после действия МХ и СВ
относительно контрольных
1,3 – контроль (интенсивность ОВ принята за 100%);
воздействие МХ (2) и СВ (4)
животных:
Особенности самих нейтрофилов, по-видимому, могут
также определять их подверженность изменениям в гомеостазе.
Популяция нейтрофилов гетерогенна, и возможно воздействие
ксенобиотиков на разные стадии дифференцировки этих клеток. За время влияния ксенобиотиков (48 ч) нейтрофилы успевали пройти часть пути своего формирования. Действительно,
от его начала в костном мозге до выхода клеток в кровяное ру
ло и их гибели проходит 10-15 дней, из
110
которых 6-10 ч нейтро-
с-
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]