Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
собствовать предотвращению повреждения миокарда при ишемии сердца (Maulik et al., 1996).
По-видимому, одной из сторон этого механизма может
быть способность СО облегчать освобождение кислорода из
эритроцитарного гемоглобина.
18000
а
16000
14000
12000
10000
Люминол+
Имп./0,2 мин.
зимозан
8000
6000
4000
024681012141618
Воздух
Время, мин.
2e5
б
1,6e5
1,2e5
80000
Имп./0,2 мин.
Люцигенин+
зимозан
40000
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18
Время, мин.
Воздух
Рис. 9.1.3. Развитие ЛМ- (а) и ЛЦ (б)-зависимой ХЛ
в отсутствие и при доступе воздуха в неразведенной крови,
индуцированной зимозаном.
Шприц объемом 2 мл с 1 мл крови в присутствии ЛМ
или ЛЦ (0,1 мМ) и зимозана (0,1 мг/мл) и 1 мл воздуха над кровью
фиксировали в счетной камере сцинтилляционного счетчика.
В периоды, отмеченные на рис. прямыми линиями над кривыми,
а воздуха к крови не было; промежутки между линиями
ступ
до
означают периоды, когда кровь аэрировали
СО обладает гораздо более высокой аффинностью к гемоглобину, чем кислород (в 220 раз более высокой). В цельной
крови для СО преимущественной мишенью является дезоксигемоглобин. Процесс усиленного освобождения кислорода
с помощью СО становится лавинообразным и может возмещать
дефицит свободного кислорода в условиях гипоксии. В свою
очередь, этот кислород может активнее потребляться нейтрофилами и другими фагоцитами – проду
всего О
•-
) в крови. И, наконец, О
2
центами АФК (прежде
•-
является «затравкой» для
2
эффективного потребления кислорода теми же нейтрофилами,
нейронами, другими видами клеток и тканей.
Это предположение может быть отчасти подтверждено
следующими результатами. Через неразведенную кровь про-
131
пускали микроколичества СО, что вызывало быструю интенсификацию ЛЦ-ХЛ, которая резко снижалась при разведении крови физиологическим раствором (рис. 9.1.4, а). Интенсификация
ХЛ происходила и в процессе развития ОВ в крови в присутствии ЛМ. В условиях аноксии при действии СО также наблюдали интенсификацию ХЛ, но менее выраженную и зависимую,
вероятно, от исходной степени насыщения гемоглобина крови
кислородом. В слу
чае же изолированных
из этой же крови нейтрофилов присутствие СО вызывало ингибирование развития
ОВ (рис. 9.1.4, б). Это и понятно. В цельной крови безусловным
преимущественным гемсодержащим белком является гемоглобин эритроцитов. Гемоглобина в цельной крови несоизмеримо
больше, чем других гемсодержащих белков, таких, как цитохромы, входящие в состав оксидореду
ктазных ферментных
комплексов.
80000
а
70000
60000
50000
40000
30000
Имп./0,2 мин.
20000
10000
0
CO
Люцигенин, 0,1 мМ
Кровь, 0,1 мл
24681012
Время, мин
Физ.раствор, 0,3 мл
Физ.раствор, 0,4 мл
1500
б
1250
Люцигенин, 0,1 мМ
1000
Нейтрофилы
(0,1 мл, 20000 кл)
Имп./0,1 мин.
750
500
246810
Время, мин.
CO
Рис. 9.1.4. Влияние монооксида углерода на ЛЦ-ХЛ
неразведенной крови человека (а)
и при барбатации суспензии нейтрофилов (б)
Последние присущи, как хорошо известно, лейкоцитам
крови, и когда они оказываются отделенными от эритроцитов,
в первую очередь уязвимыми по отношению к СО оказываются
именно гемсодержащие компоненты НАДФН-оксидазного (цитохром b
) или монооксигеназного комплекса (семейство ци-
588
тохрома Р-450 – CYP4F) этих клеток, что мы и могли наблюдать в ходе наших экспериментов (см. рис. 9.1.4, б).
Эти данные указывают на то, что нейтрофилы, во-первых,
могут использовать разные источники кислорода для продук-
132
ции АФК, регистрируемых по ЛЦ-ХЛ и ЛМ-ХЛ, и, во-вторых,
свидетельствуют о том, что нейтрофилы в неразведенной крови
постоянно продуцируют О
•-
из кислорода, получаемого от
2
эритроцитов. В свою очередь, энергия электронного возбуждения, генерируемая в реакциях с участием АФК в лейкоцитах,
может использоваться, в частности, для того, чтобы усиливать
освобождение кислорода из гемоглобина эритроцитов, как раз
и идущего на потребление аэробными клетками крови, каковыми являются лейкоциты. Высказано также предположение, что
СО, образу
емый в тканях в ус
в роли активатора освобождения эритроцитами кислорода,
облегчает его доступность не только для образования О
ловиях гипоксии, выступает
что
•-
бе-
2
лыми клетками крови, регистрируемого по ЛЦ-ХЛ, но и для
снабжения кислородом тканей организма.
9.2. Хемилюминесценция цельной крови –
результат функционирования ее АФК-генерирующих
компонентов и систем
Впервые удалось показать, что люминесценция неразведенной крови здоровых доноров всегда наблюдается, с одной
стороны, в присутствии только активатора ОВ зимозана без
участия люминофоров (рис. 9.2.1, а), а, с другой стороны, лишь
в присутствии ЛЦ без каких-либо дополнительных активаторов
(рис. 9.2.1, б), и может быть достаточно длительной (до нескольких часов) и заметно более высокой, чем в присутствии
ЛМ, а также, чем ЛЦ-ХЛ изолированных нейтрофилов.
Вероятнее всего, неразведенная кровь является источником
излучения в результате вторичных процессов, обусловленных
трансформацией энергии ЭВС в системе целостной крови. В свою
очередь, эффективность развития излучения в неразведенной крови должна зависеть от скорости освобождения кислорода гемоглобином. ЛЦ, в частности, способен возбуждаться за счет поглощения энергии излучения крови и излучать свой спектр, регистрируемый в сине-зеленой области (Cam
pbell, 1988).
133
1600
а
1400
1200
1000
800
600
Имп./0.1 мин.
400
Среднее значение фона флакон с пробиркой "Эппендорф"
200
0
0 1200 2400 3600 4800 6000 7200 8400 9600 10800
Время, минХ0.1
1,6e5
б
1,4e5
1,2e5
1e5
80000
60000
Имп./0,1 мин.
40000
20000
0
Люцигенин, 0,1мМ
2 4 6 8 10
hhhhhh
Время, час.
12
Рис. 9.2.1. Люминесценция неразведенной крови (0,1 мл) человека
в процессе развития индуцированного зимозаном (0,1 мг/мл)
окислительного взрыва (а). Продолжительная ЛЦ-зависимая
люминесценция неразведенной крови человека
в аноксических условиях. Первоначальные условия:
неразведенная кровь (0,5 мл) после 7 ч старения (хранения) (б)
В связи с этим замечанием важно отметить два аспекта:
1. По-видимому, как ЛЦ, так и ЛМ могут не только всту-
пать в реакции окисления с АФК с образованием продуктов
в ЭВС, но и выступать в роли трансмитторов энергии таких
состояний, сами переходя в возбужденное состояние с последующим высвечиванием квантов света, т.е. быть флюорофорами (Рид, 1960; Seliger, 1961; White and Roswell, 1985; Cam
pbell,
1988).
2. Вероятнее
всего, эти люминофоры являются не инерт-
ными индикаторами и усилителями ССИ биологических систем. Они могут взаимодействовать с этими системами, модифицируя их или изменяя функциональное состояние.
Эти положения всегда следует учитывать при анализе состояния крови по ее люминесценции.
9.3. Изменение хемилюминесценции неразведенной крови
у больных ишемической болезнью сердца
в ходе лазеротерапии
Нами было показано, что ХЛ неразведенной крови в при-
сутствии амплификатора ХЛ – ЛМ зависит от состояния здоро-
134
вья донора, и ее анализ может быть использован для контроля
за лечением больных ИБС, получающих курс внутривенной
лазеротерапии.
Остановимся здесь на клинических и экспериментальных
аспектах исследования. Больные ИБС находились на стационарном лечении в Центральном военном госпитале им. В.П. Мандрыка. Курс внутривенной лазеротерапии включал 10 ежедневных
сеансов продолжительностью 30 мин. Использовали низкоинтенсивный Не-Ne лазер типа АЛОК-1 (λ=633 нм, мощность луча на
выходе световода 1 мВт). Лазерная терапия сочеталась со стандарным медикаментозным лечением. Кровь у больных исследовали в динамике – до лечения, через 24 ч после 3, 7(8) и 10 сеанса. Образцы крови стабилизировали гепарином и использовали
не позднее чем через 2 ч после экстравазии.
ХЛ крови (0,2 мл) регистрировали в режиме счета одиночных фотонов с использованием уже у
жидкостного
комнатной температуре (19-21
сцинтилляционного счетчика «MARK-II» при
o
C) в полиэтиленовых пробирках
поминавшегося ранее
типа «Эппендорф» объемом 1 мл. Кровь помещали в пробирку,
регистрировали излучение в течение 2-3 мин, затем добавляли
ЛМ и следили за ХЛ не менее 3 мин.
Общий клинический анализ всех образцов крови проводили на автоматическом анализаторе «Cell-Dyn 2000/1500»
Sequoia-Turner Corp. Способность нейтрофилов восстанавливать
НСТ оценивали по общепринятому методу (Park et al., 1968).
Рассчитывали относительную активность нейтрофилов (цитохимический показатель активности – ЦПА), учиты
ва
я заполненность цитоплазмы гранулами диформазана. Вязкость плазмы
крови определяли с помощью стандартного вискозиметра.
ХЛ анализ крови 15 здоровых доноров показал, что в течение 10 мин после введения в кровь ЛМ в 10 случаях интенсивность излучения не превышала 2-3 фоновых значений,
в трех случаях наблюдался постепенный рост интенсивности
ЛМ-ХЛ, достигавший 5-7 фоновых значений. В двух слу
чаях
135
сразу после введения в кровь ЛМ интенсивность возрастала до
10-15 фоновых значений и далее не менялась. При введении
ЛМ в кровь больных стабильной стенокардией II и III функционального класса, поступивших на плановое лазеротерапевтическое лечение, в 16 случаях из 25 интенсивность излучения
сразу возрастала до значений, превышаюших фоновые от десятков до нескольких сот раз, в 5 слу
чаях
она повышалась
в течение 10 мин до значений выше фоновых в 20-30 раз
и в 4 случаях не превышала 5 фоновых значений. У больных
с исходно высокими уровнями ЛМ-ХЛ ее интенсивность после
3-го сеанса лазеротерапии снижалась, однако в ряде случаев
после следующих сеансов возрастала. Если же исходная интенсивность ЛМ-ХЛ крови пациента была низкая, в ходе лазеротерапии наблюдалось ее увеличение. Состояние этих больных,
как правило, не улучша
Больной М., 63 лет. Диагноз: ИБС, стабильная стенокардия функ-
ционального класса III, недостаточность кровоообращения 1-й степени.
Введение ЛМ в кровь, взятую до лечения, сопровождалось резким повышением интенсивности ХЛ (рис. 9.3.1).
После 3-го сеанса лазеротерапии уровень ЛМ-ХЛ крови существенно снизился, хотя в результате встряхивания образца ее интенсивность начинала расти. После 8-го сеанса значительных изменений в динамике ЛМ-ХЛ по ср
встряхивание уже не вызывало дополнительного роста ХЛ. После 8 сеансов состояние больного было оценено как хорошее. Когда через 10 мес
этот же больной вновь поступил для прохождения планового курса лазеротерапии, интенсивность ЛМ-ХЛ его крови не превышала двух фоновых значений, по
сеанса интенсивность ХЛ через 8 мин после введения ЛМ в кровь превысила фоновый уровень в 25 раз. За время лазеротерапии у этого больного
отмечен легкий приступ стенокардии.
сле 3-го сеанса она несколько возросла, а по
лос
ь. Приводим несколько примеров.
авнению с 3-м сеансом не прои
зошло, однако
сле 9-го
Поскольку в ходе настоящего исследования было отмечено еще 2 подобных случая, в дальнейшем, если ЛМ-ХЛ неразведенной крови была слабо выражена, лазеротерапия не назначалась и больной продолжал принимать медикаментозное лечение.
136
2,8e5
Имп./0,2 мин.
2,4e5
2e5
1,6e5
1,2e5
80000
40000
Люминол,
0,1 мМ
Встряхивание
1
2
3
0
0 5 10 15 20 25 30
Время, мин.
Рис. 9.3.1. Люминолзависимая ХЛ крови больного ИБС М:
перед лазеротерапией (кривая 1), после 3-го сеанса (кривая 2)
и после 8-го сеанса (кривая 3)
Больной С., 73 лет. Диагноз: ИБС, стабильная стенокардия функ-
ционального класса III. Выписан после 10-го сеанса лазеротерапии
в удовлетворительном состоянии. Диагностическая картина заболевания
почти не изменилась. ЛМ-ХЛ крови этого больного значительно снижалась по
сле 3-го и 7-го сеансов, но по
сле 10-го сеанса параметры ЛМ-ХЛ
крови возвращались к таковым до начала терапии (рис. 9.3.2).
1,4e5
4
1
3
2
Имп./0,2 мин.
1,2e5
80000
60000
40000
20000
1e5
Люминол,
0,1 мМ
0
246
Время, мин.
Рис. 9.3.2. Люминолзависимая ХЛ крови больного ИБС С:
перед лазеротерапией (кривая 1), после 3-го сеанса (кривая 2),
после 7-го сеанса (кривая 3) и после 10-го сеанса (кривая 4)
лазерот
ерапии
137
Больная Т., 69 лет. Диагноз: ИБС, стабильная стенокардия функционального класса III. Анализ ЛМ-ХЛ крови после 3, 7 и 10-го сеансов
показал близкое сходство с примером, представленным на рис. 9.3.2
(больной С.). Больная Т. выписана в удовлетворительном состоянии.
Повторный курс лазеротерапии проведен через 6 мес. На этот раз после
3-го сеанса интенсивность ЛМ-ХЛ крови снизилась почти в 10 раз, по
7 и 10-го сеансов
уровень ЛМ-ХЛ уменьшился еще больше (рис. 9.3.3).
сле
Больная была выписана в удовлетворительном состоянии.
При сравнении показателей клинического и биохимического анализов крови больных с результатами ХЛ анализа
удовлетворительная корреляция была отмечена лишь между
изменениями в ходе терапии функциональной активности нейтрофилов (НСТ-тест, ЦПА), вязкости плазмы и уровнем ХЛ
крови для каждого индивидуума.
1,11e5
61000
1
11000
6000
Имп./0,2 мин. (Логарифмическая шкала!)
1000
12345678910111213141516
Время, мин.
Встряхивание
2
4
3
Рис. 9.3.3. Люминолзависимая ХЛ крови больной ИБС Т:
перед лазеротерапией (кривая 1), после 3-го сеанса (кривая 2),
после 7-го сеанса (кривая 3) и после 10-го сеанса (кривая 4)
В табл. 9.3.1 представлены два примера такого сравнения:
для пациентов М. (хороший исход терапии после первого курса) и С. (удовлетворительный исход терапии).
НСТ-тест и ЦПА, описывающие функциональную активность нейтрофилов больного М., в ходе терапии снижаются, что
соответствует изменению показателей ЛМ-ХЛ (см. рис. 9.3.1).
Вязкость плазмы сначала возрастает, а затем уменьшается до
138
значений более низких, чем до лазеротерапии. У больного С.
НСТ-тест изменялся в течение терапии не системно, и изменение интенсивности ЛМ-ХЛ в данном случае (см. рис. 9.3.2) лучше коррелировало с изменениями вязкости плазмы.
Результаты клинического анализа крови больных М. и С.
Таблица 9.3.1
Вязкость
плазмы,
усл. ед.
Больной
M.
С.
Сеанс
лазеротерапии
Перед началом
терапии
После 3-го
сеанса
После 8-го
сеанса
Перед началом
терапии
После 3-го
сеанса
После 7-го
сеанса
После 10-го
сеанса
НСТ-тест,
%
48 1,46 1,5
20 0,50 1,8
2 0,04 1,2
37 1,25 1,9
41 0,97 1,5
35 0,80 1,5
37 0,86 2,1
ЦПА
Внутривенная лазеротерапия с использованием низкоинтенсивного He-Ne лазера в настоящее время широко применяется для коррекции очень многих дисфункций. Однако до сих
пор нет единой точки зрения на механизм терапевтического
действия низкоинтенсивного лазерного излучения (Karu, 1995),
а применяемые в клинической практике условия лазеротерапии
(интенсивность облучения, число и продолжительность сеансов
и интервалы между сеансами) часто выбираются достаточно
произвольно. Для оценки индивидуальной реакции больного на
лазеротерапию необходим был простой, быстрый и объективный метод диагностики. Для анализа ЛМ-ХЛ, содержащей антикоагулянт неразведенной крови больных ИБС, достаточно
139
0,1-0,2 мл, которая не требует предварительной обработки.
Время анализа не превышает нескольких минут.
Peзкое увеличение излучения ЛМ при его введении
в кровь большинства обследованных нами больных указывает
на присутствие в ней особо активных форм кислорода, таких,
как СlO
•-
(Allen, 1986), а снижение интенсивности излучения
в ходе лазеротерапии – на уменьшение их стационарного уровня. Причины, по которым внутривенное облучение циркулирующей крови сопровождается через сутки после облучения
снижением содержания АФК в крови больного, тогда как подобное облучение экстравазированной крови приводит к активации в ней нейтрофилов и к повышению содержания в ней
АФК (Щепеткин и др., 1993), требуют специального анализа.
140
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]