Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
филы циркулируют в крови, мигрируют в брюшную полость,
вновь возвращаются в кровь и т.д. вплоть до своей гибели (Маянский, 1990). Кондиционирование нейтрофилов может происходить на различных стадиях формирования. Во-первых, возможна прямая индукция ксенобиотиками монооксигеназной
системы в костном мозге (Цырлова и др., 1986), за счет чего
нейтрофилы, выходящие в кровяное ру
сло, уже имеют
повышенный уровень активности, результатом которого может быть
более интенсивная, чем у неактивных нейтрофилов, ХЛ. Вовторых, вероятен вклад в кондиционирование нейтрофилов их
цитохром Р-450-зависимой системы. Как полагают, она может
находиться как в плазматической мембране иммуноцитов
и выполнять функцию «хемоанализатора» (Ковалев и Полевая,
1985), так и локализоваться в ЭР нейтрофилов в виде специализированной цитохром-Р-450-зависимой системы. Последняя
принимает у
частие, как
мы уже отмечали, в регуляции активности НАДФН-оксидазы, ответственной за генерацию АФК
во время ОВ. По-видимому, повышенная активация оксидазы
в результате действия ксенобиотиков может быть связана с их
способностью индуцировать избранные формы цитохрома Р-450.
Нам впервые у
далось зарегистрировать в су
спензии нейтрофилов из крови крыс индукцию активности ЭКОД МХ и СВ.
При этом О-деэтилирование 7-ЭК в нейтрофилах крови кон-
трольных животных не наблюдалось. Однако мы наблюдали
различную скорость деэтилирования, вызванную этими индукторами. Приводим результаты одного из трех независимых экспериментов (рис. 7.2.2.2).
Из рис. 7.2.2.2 видно, что скорость О-деэтилирования
7-ЭК в монооксигеназной системе нейтрофилов крови крыс,
подверженных действию МХ, была более чем в 2 раза выше
скорости ЭКОД после введения животным СВ. Таким образом,
происходило однонаправленное изменение интенсивности ОВ
в нейтрофилах (см. рис. 7.2.2.1) и их деэтилазной активности.
7-ЭК является су
бстратом, который могут метаболизиро-
вать ряд форм цитохрома Р-450. Однако синтезируются ли
формы
семейства СYP1A (см., например, Lisitsa et al., 2001),
111
характерные для индукции ксенобиотиками МХ-типа, или происходит каким-то образом активация присущих нейтрофилам
форм семейства CYP4F (Bednar et al., 2000), пока сказать трудно. Отметим лишь, что при контроле степени индукции по
оценке деэтилазной активности микросомных препаратов печени, полученных из тех же крыс, у которых отбирали кровь
и выделяли из нее фракцию нейтрофилов, она была заметно
выражена как после воздействия МХ, так и после воздействия
СВ. И в этом же слу
чае наблюдали
бóльшую активность
О-деэтилирования 7-ЭК микросомной фракции печени животных
после ее индукции МХ по сравнению с индукцией СВ.
1700
1690
клеток
6
1680
1670
1660
1650
1640
1630
1620
1610
1600
Образование 7-оксикумарина, пмоль/10
1. После индукции
метилхолантреном:
56,1 пмоль/106 кл. в мин.
120 150 180 210
Время (сек) после добавления НАДФН, 10
Рис. 7.2.2.2. Деэтилазная активность в суспензии нейтрофилов,
выделенных из крови индуцированных МХ (1) и СВ
Кинетика
флюоресценции 7-ОК (при λ = 460 нм),
продукта деэтилирования 7-ЭК
1
2
2. После индукции
соволом:
24,2 пмоль/106 кл. в мин.
-4
М
(2) и крыс.
Наряду с влиянием ксенобиотиков на функциональный
ответ нейтрофилов возможно и непосредственное воздействие
ксенобиотиков или продуктов их метаболизма на нейтрофилы
in vivo. Это может повлечь за собой, в частности, изменение
физико-химических свойств плазматических мембран этих клеток. В связи с этим с помощью метода спиновых зондов (Кольтовер, 1979) следили за изменением микровязкости мембран
112
нейтрофилов после введения крысам МХ и СВ. Показателем
изменения микровязкости мембран служил параметр 2А
max
спектра ЭПР спинового зонда 5-ДС. Уменьшение микровязкости мембраны приводило к ускорению движения зонда в мембране и тем самым к уменьшению параметра 2А
. При увели-
max
чении микровязкости мембраны значение этого параметра возрастает (Кольтовер, 1979). Спектр ЭПР 5-ДС в каждом препарате нейтрофилов регистрировали не менее 3 раз в разных его
порциях. На рис. 7.2.2.3 представлены средние величины значений 2А
3 серий экспериментов. Исходя из высокой чувст-
max
вительности метода, получены достаточно хорошие сходимости измеряемой величины в одинаковых условиях. Разрешающая способность используемого ЭПР-спектрометра позволяла
считать различия в значениях 2А
в пределах 1-2 Гс досто-
max
верными. Полученные результаты могут свидетельствовать
о том, что изменение параметра 2А
в присутствии нейтрофи-
max
лов связано с нарушениями упорядоченности мембран этих
клеток после воздействия на крыс МХ или СВ.
Причем эти изменения отличались в зависимости от того,
какую популяцию нейтрофилов исследовали: выделенную из
крови крыс, подвергавшихся действию МХ или СВ.
Как видно из рис. 7.2.2.3, значение параметра 2А
max
повышалось при связывании 5-ДС с мембранами нейтрофилов из
крови животных, подверженных действию этих ксенобиотиков,
относительно контрольных. Причем после влияния МХ это
превышение оказывалось бóльшим, чем после действия СВ.
Одно из вероятных объяснений этого феномена состоит
в том, что высокогидрофобный МХ может непосредственно
взаимодействовать с мембранами нейтрофилов in vivo, повышая
их микровязкость.
Причем можно полагать, что такое влияние на нейтрофилы могло сказываться постоянно в течение двух суток воздействия на животных МХ, т.
е. от стадий поэза до циркулирующих
в крови нейтрофилов разной зрелости и гетерогенности. Что
касается менее значимого увеличения 2А
в присутствии ней-
max
113
трофилов после воздействия СВ на крыс in vivo, то это могло
быть связано с отличиями между свойствами индукторов, которые уже отмечались выше. Можно также предположить, что
повышенная регидность мембран нейтрофилов способствует
увеличению оксидазной активности и ускорению генерации
АФК, что проявляется в усилении ХЛ.
Рис. 7.2.2.3. Параметр 2А
в присутствии нейтрофилов крыс:
1 – контрольные крысы; после введения МХ (2) и СВ (3)
спинового зонда 5-ДС
max
Исходя из концепции иммунохимической функции гомеостаза (Ковалев и Полевая, 1985), можно полагать, что такие
сильные ксенобиотики, как СВ и МХ, привносят в процессе
своего двухсуточного индукционного действия и метаболизма
заметные сдвиги в гомеостазе организма, которые, вероятно,
могут привести к модификации не только пути формирования
нейтрофилов, но и их морфофункциональные свойства. В частности, обнаруженные изменения в спектре ЭПР спинового зонда в присутствии различных нейтрофилов могут у
такую
возможность.
114
азывать на
к
Примечательно, что направленность изменений 2А
max
аналогична таковой в активности ОВ нейтрофилов и деэтилазной активности их монооксигеназной системы. Однако говорить с твердой уверенностью о прямой корреляции между
этими двумя проявлениями действия ксенобиотиков пока
преждевременно, хотя такая взаимосвязь может оказаться
значимой.
115
ГЛАВА VIII
СВЕРХСЛАБОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ ЖИВЫХ ОБЪЕКТОВ,
КАК РЕЗУЛЬТАТ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ
ПРОЦЕССОВ
За последнее время в литературе описан относительно
большой экспериментальный материал, посвященный тому, что
большинство клеток и тканей организма имеет специальные
ферментные системы, ответственные за постоянное образование
АФК, как мы указывали на это в главе I (Владимиров, 1966; Владимиров и Шерстнев, 1989; Meier et al., 1991; Goeptar et al., 1995;
O’Donnel and Azzi, 1996; Jones et al, 1996; Гамалея и Клыбин,
1996; Babior, 1999; Ту
рпаев, 2002 и др.)
Учитывая довольно большую распространенность систем,
генерирующих АФК в живых организмах, было бы трудно
предположить, что все они созданы только во вред живому.
Ранее в основном су
ществовали представления о повреждающей роли АФК и других свободных радикалов за счет инициации ПОЛ. Но при этом оставались незамеченными некоторые
особенности этого процесса. Так, например, не обсу
имеет ли физиологическое значение тот
факт, что в липидах
ждалось,
клеточных мембран, различных тканях и органах нормально
функционирующего организма всегда можно обнаружить значимые количества первичных и вторичных продуктов ПОЛ
и что при этом не наблюдается выраженных нарушений гомеостаза. Не придавали должного значения возможной роли МДА
и других так называемых «ТБК-активных проду
ктов»,
как карбонильных соединений, в трансформации и умножении энергии
электронного возбуждения и таким образом поддержанию процессов «горения» в организме (Cilento and Adam, 1995; Баскаков и Воейков, 1996). Это такие процессы, которые не требуют
затрат энергии АТФ и, мало того, как было показано уже в 90-е
116
годы прошедшего столетия, без них не могут быть осуществлены реакции освобождения энергии, запасенной в молекуле
глюкозы, т.е. реакции гликолиза и цикла Кребса (Кондрашова,
1989).
Cледствием релаксации ЭВС, возникающих в ходе сво-
бодно-радикальных окислительно-восстановительных реакций,
в частности, пероксидации некоторых молекулярных субстратов, является
ССИ живых клеток и тканей (Владимиров и Арчаков, 1972; Владимиров и Шерстнев, 1989). ССИ, как уже сейчас
становится ясным, не является побочным фактором в процессе
генерации ЭВС, а выполняет определенные значимые функции
в жизнедеятельности организмов.
ССИ может объясняться флюоресценцией синглетного
кислорода и его димеров и фосфоресценцией возбужденных
карбонильных соединений, получающихся в результате распада
диоксиэтанов и тетраоксидов. В определенных ус
виях такие
ло
реакции, сопровождающиеся ССИ, могут протекать по механизму так называемых вырожденно-разветвленных цепных
процессов. Физико-химическая система, в которой протекают
такого рода процессы, переходит из квазиравновесного состояния со средой в неравновесное, причем в определенных условиях ее неравновесность может поддерживаться в течение длительного времени за счет постоянной продукции в ней активных частиц
(Воейков, 2003).
В реакциях рекомбинации свободных радикалов и в реакциях ферментативного и неферментативного расщепления перекисных соединений освобождаются порции энергии, эквивалентные квантам видимого и даже ультрафиолетового света
(Voeikov, 2001).
То, что живые организмы, их ткани и клетки при своем
активном делении способны излучать УФ-фотоны, обладающие
митогенетическим эффектом, было установлено русским ученым А.Г. Гу
рвичем и его
сподвижниками еще в 20 – 30-е годы
ХХ века (Gurwitsch, 1924), которые для обнаружения этого излучения использовали биотесты. Оказалось, что свежая нераз-
117
веденная кровь человека является относительно более сильным
источником митогенетического излучения по сравнению с другими тканями.
Сейчас уже нет сомнений в том, что ткани и клетки живых организмов способны излучать более длинноволновый, чем
УФ, свет, невидимый невооруженным глазом, но тем не менее
информирующий о некоторых важных окислительно-восстановительных реакциях в клетках, обязательными у
которых
являются АФК и другие свободные радикалы, приво-
частниками
дящие к образованию электронно-возбужденных продуктов.
Впервые систематические исследования ССИ живых объектов с помощью высокочувствительных установок с применением ФЭУ проводились с конца 50-х и в 60-е годы прошлого
века под руководством профессора Б.Н.Тарусова на кафедре
биофизики биологического факультета МГУ. Было обнару
ССИ широкого кру
га интактных органов, изолированных кле-
жено
ток, тканевых гомогенатов позвоночных и беспозвоночных животных, растений и ряда реакций в пробирке. В подавляющем
большинстве случаев испускаемый живыми системами свет
лежит в области сверхнизких интенсивностей, но даже если
целый ряд организмов способен к биолюминесценции, т. е. испу
скает свет, видимый невоору
женным глазом, они за счет наличия особых белков [например, так называемых «зеленых белков» (Labas et al., 2002)] с очень высоким квантовым выходом
преобразуют в видимый свет энергию, освобождаемую все при
том же одноэлектронном восстановлении кислорода.
В отличие от сильной биолюминесценции, хорошо видимой, присущей некоторым представителям бактерий и животного мира, излучающим до 10
3
-104 фотонов в 1 с с высоким
квантовым выходом (φ = 0,1-1) и ХЛ некоторых химических
реакций (φ = 0,01-0,5), ССИ характеризуется в 10
3
-108 раз более
слабой интенсивностью (Тарусов, 1972; Журавлев, 1972;
Campbell, 1988; Slawinski, 1988). Спонтанная эмиссия света
часто не превышает 1 фотона в 1 с на клетку, а в пересчете на
орган составляет до 10
4
фотонов в 1 с на см2 излучающей по-
верхности ткани, или это эквивалентно излучению 20 000 фо-
118
тонов в 1 с из 1 см3. Рассчитано, что если индивидуальная клетка
(например, гепатоцит) имеет радиус 20 мкм, то в одном см
держится 2,5•10
8
клеток, поэтому на клетку приходится 8•108
3
со-
излучаемых в 1 с фотонов. Обычно реакции, ответственные за
сверхслабую ХЛ, имеют максимально низкий квантовый выход
(φ бывает в пределах 10
-3
-10-8, а иногда и 10-9-10
-15
).
Реализация энергии ЭВС может идти различными путями
в зависимости от того, в каких условиях возникли продукты
электронного возбуждения. Если ЭВС генерируются достаточно редко и в условиях, когда возбужденные частицы за счет
броуновского движения случайно сталкиваются с невозбужденными и разнородными молекулами, энергия возбуждения
почти сразу переходит в тепловую. При этом возможен, но
с малой вероятностью, спонтанный переход частиц из возбужденного состояния в основное, сопровождающийся излучением
кванта света. При наличии в среде, клетках, тканях субстанций,
способных поглотить этот квант, они возбуждаются, а далее
либо высвечивают его, либо переводят в тепло.
Энергия от возбужденной частицы к невозбужденной может передаваться и безызлучательным путем. Такой перенос
осу
ществляется практически
мгновенно на большие в молекулярных масштабах расстояния и реализуется тем эффективнее,
чем выше уровень структурной организации (Bacchiocchi and
Zannoni, 1997; Воейков, 2003). Именно такие условия характерны
для внутренней среды живых организмов, их тканей и клеток, где
благодаря наличию определенным образом структурированной
воды, за счет этого молекулярной и надмолекулярной организованности цитоплазмы должна су
ность рассеивания энергии
ЭВС в тепло, но повыситься вероят-
щественно снизиться вероят-
ность ее накопления в макромолекулах, надмолекулярных ансамблях и безызлучательного перераспределения между ними.
Хотя до сих пор большинство авторов считает, что ССИ –
это побочное явление, не играющее функционально значимой
роли, однако еще А.Г. Гурвич на основании громадного фактического материала, полученного им и другими авторами, работавшими в этой области, у
тверждал, что электронное возбуж-
119
дение в живых клетках возникает закономерно в ходе нормального обмена веществ и необходимо для нормальной жизнедеятельности (Gurwitsch, 1924). И в последнее время появилось
много свидетельств того, что в живых системах постоянно протекают процессы, приводящие к непрерывному возникновению
электронно-возбужденных частиц. За счет их энергии в клетке
могут осуществляться энергоемкие процессы, фотомоду
ваться активность ферментов и т.
д. Излучения в разных облас-
лиро-
тях спектра могут иметь функциональное значение, причем их
регуляторная функция реализуется, как правило, в области
очень низких интенсивностей. Кроме того, возможно, что создаваемое ансамблями возбужденных частиц электромагнитное
поле и излучения, сопутствующие его осцилляциям, играют,
как указывал А.Г. Гу
стоящее время обсуждается в ряде работ
рвич, информационную роль, что в на-
современных исследователей (Казначеев и Михайлова, 1981; Galantsev et al., 1993;
Novikov et al., 1994; Кузин, 2000; Бурлаков и др., 2000).
Интенсивность и некоторые другие параметры ССИ могут
меняться в зависимости от состояния самого живого объекта, его
физиологических и биохимических особенностей, от силы и характера воздействий, влияющих на разные у
ской организации. В разные периоды жизнедеятельности
ровни биологиче-
меняется метаболическая активность живых организмов и соответственно меняется эффективность ССИ, причем, может это происходить весьма существенно. При усилении потребления кислорода световой сигнал повышается от 2 до 10 раз в зависимости от
ткани. Различные воздействия на организмы, органы и ткани,
клетки и их стру
ктуры
могут достаточно разнообразно изменять
параметры ССИ. Например, в логарифмической фазе роста культуры дрожжей Saccharomyces cervisiae ССИ более интенсивно,
чем в стационарной фазе. Максимум световой эмиссии от
10
10
клеток примерно 5х105 фотонов в 1 с, что эквивалентно
1 фотону на каждые 20 000 клеток. Однако при пересчете числа
фотонов только на делящиеся клетки обнаруживается многократное относительное усиление их образования: 0,1-1 фотона
на 1 делящуюся клетку (Allen, 1986).
120
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]