Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
11.5. В качестве спиновой ловушки использовали С-фенил-
N-
трет
-бутилнитрон (II) (ФБН) (Emmons, 1957), синтезированный в лаборатории радиационной химии МГУ им. М.В. Ломоносова. Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре
«Varian E-4» (США).
12. Условия инкубации гепатоцитов,
индукции процесса ПОЛ, определения его продуктов
и количества цитохрома Р-450
Изолированные клетки печени в виде суспензии в среде
Тироде инкубировали на качалке (1 об./с) при температуре 37˚С
в колбах, закрытых марлевыми пробками. Стандартная суспензия гепатоцитов содержала (2 – 4) •106 клеток в 1 мл. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 7075% неповрежденных клеток.
Переокисление липидов в суспензии гепатоцитов индуцировали системой Fe2+-АДФ (5•10-5 М)+НАДФ-Н (10-4М). Антиоксиданты ионол, оксипиридин-6 (ОП-6) и 1,2,3триоксибензол (пирогаллол) вносили в суспензию гепатоцитов
так, чтобы конечная концентрация составляла 10-4 или 5•10-5 М.
БП (10-4 М) вносили в суспензию гепатоцитов в ацетоне (конечная концентрация последнего была не более 0,5%). Ионол и
пирогаллол вносили в этиловом спирте так, чтобы концентрация спирта не превышала 1%. ОП-6 вносили в среде Тироде.
Накопление МДА в суспензии гепатоцитов выявляли через определенные интервалы времени по реакции с ТБК. Количество МДА измеряли по спектру поглощения (λ
триметинового комплекса (Е
= 156000 М-1см-1). Содержание
535
=535 нм)
макс
цитохрома Р-450 проводили, как описано выше. Количество
цитохрома Р-450 в нативных гепатоцитах составляло
0,109+0,021 нмоль на 106 клеток, что соответствует данным
литературы (Allen et al., 1981; Levine, 1982).
Все получаемые результаты представляли в виде относительных средних величин и обрабатывали статистически по
критерию Стьюдента.
191
13. Методические аспекты исследования
люминесценции нейтрофилов и цельной крови
13.1. Из довольно большого ряда выпускавшихся и выпускаемых промышленностью (в том числе и в России) люминометров не все подходят для изучения особенностей ССИ живых объектов. Для регистрации ССИ наиболее адекватны приборы, ФЭУ которых настроены на режим счета фотонов при
высоком отношении сигнала к шуму. К такого рода приборам
относятся сцинтилляционные счетчики радиоактивности, использование которых, как люминометров (отношение сигнала
к шуму 10:1), началось в 1970-е годы (Kalbhen, 1980). Измерение ХЛ образцов крови, су
сцинтилляционном счетчике радиоактивности «
спензии нейтрофилов проводили на
MARK-II»
(Nuclear-Chikago, США), снабженным двумя ФЭУ с фотокато-
дами S-11 и диаметром окна 5 см типа EMI 9750QB/1 (Англия),
в режиме счета одиночных фотонов не в системе совпадений
(одним ФЭУ) в тритиевом окне. Область спектральной чувствительности ФЭУ – 300-600 нм; область максимальной спектральной чувствительности – 380-490 нм; длина волны максимальной чувствительности – 420 нм. Как видно, наибольшая
чувствительность ФЭУ лежит в сине-зеленой области спектра,
а максимум этой чувствительности близок к длинам волн эмиссии света возбужденных ЛМ (λ
= 427 нм) и ЛЦ (λ
исп
= 470
исп
и 512 нм) (или продуктов их окисления АФК). ФЭУ вегда расположен горизонтально и регистрировал потоки фотонов с боковой поверхности образцов. Темновой ток ФЭУ в камере измерения варьировал от 2400 до 3000 импульсов в мин.
13.2. Для исследований использовали венозную или кровь
из пальца у здоровых доноров (21-55 лет), а также у больных
с различными хроническими заболеваниями. Кровь стабилизировали гепарином (от 20 до 200 ед./мл в зависимости от условий экспериментов) или
3,5% цитратом натрия (1 мл на 9 мл
крови) и использовали вплоть до 1 сут. после ее взятия. Пробы
крови хранили при +4°С (в ряде случаев – при комнатной тем-
192
пературе) в пробирках, герметично закрытых пробками, или
в пластиковых шприцах без доступа воздуха, а перед использованием ее выдерживали при комнатной температуре не менее 1 ч.
13.3. Нейтрофилы выделяли из крови людей по той же
методике, которая приведена в п. 7. Для регистрации ЛМ-ХЛ
и ЛЦ-ХЛ люминофоры («Sigma», США) вносили в кровь или
в су
спензию нейтрофилов из растворов, приготовленных на
ДМСО («
Merk», Германия) и физиологическом растворе, соответственно, до конечной концентрации 0,1 мМ. ОВ индуцировали в крови и изолированных нейтрофилах зимозаном
(«Sigma», США) (конечная концентрация 0,1 мг/мл) или
ФМА (10
-7
М). В случае крови использовали как опсонизиро-
ванный, так и неопсонизированный зимозан, так как в цельной
крови происходит естественное связывание этого активатора ОВ
с опсонинами плазмы /иммуноглобулами G (IgG, IgM)/(Roos et al.,
1981). В суспензию нейтрофилов обязательно вносили педварительно опсонизированный зимозан.
13.4. Процесс опсонизации – это необходимая стадия активации лейкоцитов, их фагоцитарной способности. Опсонизацию
зимозана проводили по следу
ющей методике
: 25 мг зимозана А
суспендировали в 1,25 мл среды выделения нейтрофилов (или
в физиологическом растворе) и добавляли равный объем сыворотки крови здоровых доноров. Суспензию инкубировали в течение 30 мин при 37°С и периодическом перемешивании, а затем
центрифугировали при 170g и 4°С в течение 5 мин. Полученный
осадок суспендировали в 2 мл среды (физраствора) и центрифугировали в том же режиме. Такого рода отмывку повторяли
3 раза. Опсонизированный зимозан ресу
(физрастворе) до концентрации 10
мг/мл и хранили небольшими
спендировали в среде
порциями в замороженном состоянии, используя по мере необходимости и разводя суспензию до рабочих концентраций.
13.5. Кровь (суспензию нейтрофилов) для регистрации ее
излучения помещали (если не у
казано
особо) в стандартные флаконы для сцинтилляционного счета (стеклянные или пластиковые) или полипропиленовые пробирки типа «Эппендорф». Кинетические кривые записывали с временем накопления импульсов
193
от 1 с до 1 мин. Все измерения проводили при тусклом внешнем
освещении и температуре 19-21°С без перемешивания образцов
крови. При изучении влияния аэрации на излучение кровь помещали в 2-миллилитровые пластиковые шприцы и регулировали
содержание воздуха с помощью поршня. В некоторых экспериментах контейнеры с кровью помещали в счетную камеру и регистрировали излучение в течение длительного времени, не тревожа образец. Также применяли циклический режим, когда последовательно регистрировали излучение из нескольких образцов крови, помещенных в ячейки бесконечного конвейера счетчика. В работе приводятся типичные кривые люминесценции для
крови всех доноров. Для графических целей и обработки резу
татов использовали программный пакет «S
TATISTICA» for
ль-
Windows.
13.6. В ходе многочисленных исследований
оказалось,
что метод ХЛ неразведенной цельной крови может быть предложен как хороший экспресс-тест-метод. Во-первых, для анализа необходимо незначительное количество крови (несколько
десятков микролитров), хотя возможно тестирование и значительно больших объемов крови (до 20 мл).
Во-вторых, можно многократно из относительно небольших порций крови отбирать для повторных измерений аликвоты и тестировать их несколько раз. Ограничивающим фактором
здесь может быть точность пипеток, используемых для внесения необходимых добавок и устойчивость образцов тестиру
крови.
мой
е-
Следует отметить, что использование в биотестировании
целостных характеристик крови, в основе которых лежит инициация реакций АФК и ЭВС, ответственных за ХЛ, требует еще
своего развития. Наши исследования свойств ХЛ цельной неразведенной крови использованы для разработки метода слежения за ходом низкоинтенсивной лазеротерапии больных ИБС.
Результаты этих исследований защищены патентом «Способ
контроля за состоянием больных ИБС в ходе лечения внутривенной низкоинтенсивной лазерной терапией»
(23 марта 1999
г.)
(Воейков и др., 1999).
194
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 3
ГЛАВА I. Происхождение активного кислорода
и возможности его участия в различных реакциях
свободно-радикального характера 9
1.1. Реакции, приводящие к образованию АФК 9
1.2. Системы, способствующие генерации АФК
и других свободных радикалов 12
1.3. Субстраты свободно-радикальных реакций и методы
определения продуктов их взаимодействия 13
1.4. Системы, регулирующие свободно-радикальные
процессы – антиоксиданты 16
1.5. Двоякая роль АФК и свободно-радикальных реакций
в жизнедеятельности 18
ГЛАВА II. Свободно-радикальные процессы
в биосистемах при воздействии физических факторов 24
2.1. Свет и роль свободно-радикальных реакций
в зрительной рецепции 24
2.1.1. Условия, способствующие активации АФК
и свободно-радикальных реакций в структурах глаза 24
2.1.2. Возможные механизмы активации кислорода
и свободно-радикальных состояний в фоторецепторной
системе 27
2.1.3. Ферментные и неферментные системы регуляции
образования АФК и перекисей липидов в мембранах
фоторецепторов 29
2.2. Радиоактивность и свободно-радикальные процессы
в биосфере 37
195
2.2.1. АФК при монооксигеназном окислении в ЭР 37
2.2.2. Монооксигеназные активности плаценты жителей
Алтайского края, подвергавшихся действию испытаний
ядерного оружия 41
ГЛАВА III. Оценка свободно-радикальных реакций
на микросомной модели при различных воздействиях 47
3.1. Анализ состояния проблемы 47
3.2. Механизмы инициирования ферментативного
НАДФН-зависимого ПОЛ в микросомах печени крыс 50
3.3. Взаимосвязь процессов ПОЛ и протеолиза
в деградации цитохром Р-450-зависимой системы
детоксикации ксенобиотиков в микросомах печени крыс 57
ГЛАВА IV. Антиокислительная активность некоторых
лекарственных препаратов в микросомной системе
печени крыс 64
ГЛАВА V. Биохимический мониторинг экосистем
на основе монооксигеназного окисления в мембранах
эндоплазматического ретикулума рыб 73
5.1. Монооксигеназы со смешанной функцией
в микросомах печени рыб озера Байкал 73
5.2. Иммунохимический анализ индукции изоформ
цитохрома Р-450 в печени пресноводных рыб –
эффективная тест-система на воздействие
полициклическими ароматическими углеводородами
и полихлорированными бифенилами 76
5.3. Изучение ферментных и неферментных систем ПОЛ
в микросомах печени рыб озера Байкал 80
5.4. Роль фенольных производных бенз(а)пирена и фенолов –
компонентов промстоков в регуляции процесса окисления
липидов в микросомах печени рыб озера Байкал 83
196
ГЛАВА VI. Исследование механизма действия
продуктов гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А
2
на функциональную активность микросомной системы
печени крыс и рыб 88
6.1. Ингибирование деалкилазной активности изоформ
цитохрома Р-450 в микросомах печени продуктами
гидролиза фосфолипидов фосфолипазой А
88
2
6.2. Сравнительное действие продуктов гидролиза
фосфолипидов фосфолипазой А
изоформ цитохрома Р-450 в микросомах печени крыс и рыб 91
на деалкилазную активность
2
ГЛАВА VII. Свободно-радикальные процессы
в клеточных системах 94
7.1. Модель изолированных гепатоцитов как биологическая
тест-система для оценки устойчивости цитохрома Р-450 94
7.1.1 Механизмы деструкции цитохром Р-450-зависимой
детоксицирующей системы в гепатоцитах 96
7.1.2. Антиоксиданты как стабилизаторы цитохрома Р-450
в гепатоцитах 99
7.1.3. Продукты гидроксилирования БП – стабилизаторы
цитохрома Р-450 в гепатоцитах 103
7.2. Функциональный отклик нейтрофилов крови крыс
на воздействие метилхолантреном и соволом in vivo 106
7.2.1. О взаимосвязи активности иммунокомпетентных
клеток с индукцией монооксигеназной системы
ксенобиотиками 106
7.2.2. Влияние ксенобиотиков МХ и СВ на интенсивность ОВ,
активированного в нейтрофилах форбол миристат ацетатом.
Изменение микровязкости мембран нейтрофилов 109
ГЛАВА VIII. Сверхслабое излучение живых объектов,
как результат свободно-радикальных процессов 116
197
ГЛАВА IX. Роль АФК и свободно-радикальных процессов
в функциональной организации крови 126
9.1. Роль АФК в регуляции обмена кислорода
в нативной крови человека 126
9.2. Хемилюминесценция цельной крови – результат
функционирования ее АФК-генерирующих компонентов
и систем 133
9.3. Изменение хемилюминесценции неразведенной крови
у больных ишемической болезнью сердца
в ходе лазеротерапии 134
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 141
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143
ПРИЛОЖЕНИЕ. МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ 171
1. Выделение и очистка фоторецепторных мембран 171
2. Методы изучения свободно-радикальных процессов
в микросомной фракции печени млекопитающих 173
3. Применение тест-системы на основе монооксигеназных
и конъюгирующих активностей плаценты для оценки
развития желтухи новорожденных невыясненной этиологии
Алтайского региона 179
4. Методы изучения свободно-радикальных процессов
в микросомной фракции печени рыб 179
5. Методики гидроксилазной активности изоформ
цитохрома Р-450 в микросомной фракции печени рыб 182
6. Процедура выделения изолированной фракции клеток
печени крыс 183
7. Методы выделения нейтрофилов из крови крыс.
Оценка функциональной активности нейтрофилов (развитие ОВ)
и их монооксигеназной системы. Методы хемилюминесценции
и ЭПР 185
8. Условия индукции ПОЛ в различных системах 186
198
9. Определение ГП во фракции фосфолипидов 187
10. Определение содержания МДА –
молекулярного продукта ПОЛ 188
11. Системы генерации АФК
и системы регуляции АФК, ПОЛ 189
12. Условия инкубации гепатоцитов, индукции процесса ПОЛ,
определения его продуктов и количества
цитохрома Р-450 191
13. Методические аспекты исследования люминесценции
нейтрофилов и цельной крови 192
199
Кирилл Николаевич Новиков
Сергей Васильевич Котелевцев
Юрий Павлович Козлов
СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ
В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ
ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Монография
Редактор Ж.В. Медведева
Технический редактор Л.А. Горовенко
Компьютерная верстка Ю.А. Заикина
Дизайн обложки М.В. Рогова
Тематический план 2011 г., № 74
Подписано в печать 03.10.11 г. Формат 60×84/16. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 12,5. Тираж 500 экз. Заказ 721
Российский университет дружбы народов
115419, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д. 3
Типография РУДН
115419, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д. 3, тел. 952-04-41
200
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]