Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
ПРИЛОЖЕНИЕ
МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ
1. Выделение и очистка фоторецепторных мембран
1.1. Выделение сетчаток, мембран НС и ВС проводили из
глаз предварительно темноадаптированных (в течение 2 ч) лягушек Rana temporaria, а также из глаз морской костистой рыбы
минтай (Theragra сhа1соgrаmmа) и из глаз быков. В эксперимен-
тах использовали целые сетчатки глаз этих животных, НС или
ВС палочек сетчаток выделяли методом дифференциального
центрифугирования.
1.2. Фракцию НС из сетчаток лягушек после их темновой
адаптации выделяли по методу Kim
ura E. (1952) по следую
схеме: сетчатки помещали в 45% раствор сахарозы (d
3
1,20 g/cm
) в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7,4; суспензию гомо-
щей
=
p
генизировали и дважды центрифугировали в течение 15 мин
при 8000g. Супернатант, свободный от пигментного эпителия,
но обогащенный фракцией НС, центрифугировали в течение
30 мин при 8000g в градиенте плотности сахарозы (45%- d
3
1,20 g/cm
1,12 g/cm
(9 мл), 35% – dp = 1,15 g/cm3 (7 мл), 28% – dp =
3
(5 мл) и 5 мл Н2О). Очищенные фракции НС отбира-
ли на границе градиента плотности сахарозы 1,12 g/cm
3
1,15 g/cm
, ресуспендировали в растворе, содержащем 100 мМ
=
p
3
и
NaCl, и дважды центрифугировали в течение 30 мин при 8000g.
Осадок НС суспендировали в среде, содержащей 100 мМ NaCl
и 30 мМ трис-HCl буфере, рН 7,4.
1.3. Выделение фракции НС из сетчаток быка и минтая
проводили по методу Papermaster and Dreyer (1974) с некоторыми модификациями. Все рабочие растворы для выделения
НС быка и минтая готовили на 0,9% и 0,65% растворах NaCl
171
соответственно. Сетчатки аккуратно встряхивали и гомогенизировали в равных объемах раствора, содержащего 35% раствор
сахарозы, и 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7,2. Гомогенат фильтровали через нейлоновую газовую сеточку с порами малого
диаметра и фильтрат центрифугировали в течение 10 мин при
8000 g. Супернатант разбавляли в 3 раза раствором NaCl
и центрифугировали при тех же условиях. Осадок, содержащий
чистую фракцию НС, суспендировали в растворе сахарозы dp =
1,17 g/cm
3
) и плотность суспензии доводили до 1,15 g/cm3. Ис-
пользуя пастеровскую пипетку, суспензию (12 мл) подслаивали
под градиент сахарозы, приготовленный из двух ее растворов
(по 8 мл) с плотностями 1,13 g/cm
3
(0,87 М) и 1,11 g/cm3 (1,05 М)
соответственно. Градиенты центрифугировали в течение 30 мин
при 900 00 g. Очищенную фракцию НС собирали на границе
слоев сахарозы (1,11 g/cm
3
и 1,13 g/cm3), затем разводили
в 4 раза соответствующим раствором NaCl, центрифугировали
в течение 10 мин при 8000 g и отмывали дважды 0,25 М раствором сахарозы. Окончательный осадок лиофилизировали и
хранили при -10˚С в аргоновой атмосфере. В случае необходимости отбирали фракцию ВС сетчаток быка, лягушки или минтая, локализующуюся после центрифугирования в градиенте
плотности сахарозы в слоях
например, между 1,20 g/cm
больших плотностей (для лягушки,
3
и 1,15 g/cm3) и далее обрабатывали
эту фракцию так же, как и фракцию НС.
1.4. Сетчатки в физиологическом растворе для холоднокровных (по 10 сетчаток в пробе) или суспензии НС подвергали в
течение 30 мин темновой или световой инкубации при 2-4˚С. Ос-
вещение белым светом проводили лампой накаливания (200 Вт);
освещенность измеряли с помощью люксметра. Для освещения
светом с различными длинами волн использовали интерференционные фильтры с полосами пропускания 455+
12; 539+15; 551+10; 668+15 нм и в качестве источника све-
508+
12; 494+10;
та – лампу накаливания с йодным циклом (КИМ, 200 Вт). Градуировку по энергии падающего света различных длин волн
производили с помощью термостолбика и потенциометра Ф-116.
172
Во всех случаях добивались получения равноквантовых свето-
14
вых потоков (6,5• 10
квантов на 1 см2 за 1 с). При расчетах ис-
пользовали соотношение N = nh/λ, где N – энергия падающего
2
света в эргах, nh – число квантов на см
за 1 с; λ – длина волны
в нм. Длина волны задавалась, энергия подбиралась так, чтобы
14
nh = 6,5• 10
кв/ см2•с.
1.5. Регенерацию родопсина в суспензии НС палочек про-
водили в атмосфере аргона. 11-Цис-ретиналь, полученный по
методу (Соколова и др., 1977), добавляли к обесцвеченным НС
в 10-20-кратном избытке по сравнению с количеством родопсина и инкубировали в течение 2 ч. Для восстановления альдиминовой связи в родопсине к НС добавляли боргидрид натрия
(2 мг на пробу, инкубация 30 мин при 20°С).
1.6. С целью более точного определения содержания ро-
допсина для уменьшения рассеяния фрагментов НС после инкубации к ним добавляли равные по объему количества тритона
Х-100 до его конечной концентрации 2%. Количество родопсина определяли по дифференциальным спектрам поглощения
образцов (темновой минус обесцвеченный родопсин) при λ
500 нм в присутствии 10 мМ NH2OH, используя Е
макс
500
=
=
41000 М-1см-1 (Hubbard, 1954).
1.7. Содержание белка определяли с помощью биуретово-
го реактива, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (БСА) (Gornall et al., 1949).
2. Методы изучения свободно-радикальных процессов
в микросомной фракции печени млекопитающих
2.1. Роль АФК в реакциях инициирования процесса ПОЛ
в модельной супероксид-генерирующей системе, содержащей
аналог флавинов – N-метилфеназинметасульфат (Ф) («Gee
Lawsson», Англия) и НАДН («Реанал», Венгрия). Образование
радикалов в этой системе происходит по известной схеме
(Nishikimi et al., 1978):
173
Ф + НАДН + Н
ФН
ФН
•
•
•-
Использовали в сочетании два метода: метод спиновых
ловушек, позволяющий непосредственно изучать короткоживущие радикалы (
Emmons, 1957)
, а также следили за накоплением вторичного молекулярного продукта ПОЛ МДА (Kohn,
Liversedge, 1944; Porter et al., 1976). Принцип метода спиновых
ловушек основан на взаимодействии короткоживущего радикала со спиновой ловушкой, приводящем к образованию долгоживущего спинового аддукта, спектр ЭПР которого отражает
структуру акцептированного радикала. Если будут наблюдаться
определенные корреляции между обнаружением кислородных
радикалов и продуктами ПОЛ, то можно полагать ответственной за образование последних конкретной радикальной АФК.
2.2. Для выяснения вопроса об у
частии
в инициировании
и пролонгировании ПОЛ радикалов кислорода и липидов в системе феназинметасульфат-НАДН в присутствии ионов двухвалентного железа и ЭДТА использовали водную
ноленовой
кислоты, полученную на ультразвуковом дисперга-
эмульсию ли-
торе УЗДН-1 (22 кГц). Линоленовую кислоту («Реахим», «ч»)
предварительно очищали от продуктов перекисного окисления
на колонке с силикагелем КСК и дополнительно очищали
в двухфазной системе метанол-вода-петролейный эфир (3:1:4).
Степень очистки кислоты определяли по содержанию диеновых
конъюгатов (коэффициент молярной экстинкции Ε
21000 М
рН 7,4. Реакции проводили при 37
-1см-1
). В работе использовали 50 мМ фосфатный буфер
°
С.
=
232
2.3. В экспериментах использовали беспородных белых
крыс-самцов массой 130-180 г. В брюшную полость животного
вводили индукторы – 0,2% раствор ФБ в физиологическом растворе (80 мг на 1 кг массы), МХ (40 мг на 1 кг массы),
β-нафтофлавон (80 мг на 1 кг массы) или совол (СВ) (200 мг на
1 кг массы) в растительном масле. Через 48 или 72 ч после на-
174
чала индукции выделяли микросомную фракцию из печени
крыс методом дифференциального центрифугирования (Арчаков и др., 1968; Де-Пьер и Дальнейр, 1979). После декапитации
животных у них вскрывали брюшную полость и перфузировали
печень (через полую вену) охлажденным раствором:
0,15 М KCl, 15 мг/мл свободного от жирных кислот БСА
(Y фракция), 0,1 мМ ингибитор протеаз ФМСФ. Печень гомо
-
генизировали гомогенизатором типа «Polytron» в течение 30 с
в среде выделения, объем которой в 6-8 раз превышал объем,
занимаемый печенью. Неразрушенные клетки, ядра и митохондрии осаждали при 9000g в течение 20 мин при температуре
2-4ºС. Супернатант центрифугировали 60 мин при 105 000 g.
Полученный осадок тщательно суспендировали в стеклянном
гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в среде хранения, содержащей
20% глицерина и 50 мМ Na-фосфатного буфера
(pH 7,6). В зависимости от цели экспериментов препараты мик-
росом хранили либо в замороженном состоянии при –30ºС, либо при +2 – +4ºС.
2.4. В экспериментах по тестированию лекарств использовали белых крыс-самцов линии Sprague-Dawley массой 180200 г. Микросомную фракцию из печени выделяли по стандартной методике путем дифференциального центрифугирования в 1,15%-ном растворе KCI с добавками 15 мг/мл БСА
(Y фракция) и 1 мг/мл ФМСФ и хранили в 50 мМ Na-фосфатном буфере (рН 7,6) с добавлением 30% глицерина.
Для активации ПОЛ микросомы инкубировали в среде,
содержащей 50 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7,6) при 37°С при
сочетании следующих добавок: 1) 10-4 М НАДФН, 10-5 М
(FeSО4-АДФ); 2) 10-4 М НАДФН, 10 мкл СС14/мл; 3) 10-4 М
аскорбата, 10-5 М (FeSО4-АДФ); 4) 10 мкл СС14/мл.
Использовали также специальную систему преимущественного метаболизма субстратов цитохрома Р-450 (в присутствии НАДФН) с последующей добавкой Fe2+-АДФ для активации ПОЛ, чтобы выявить лекарства – субстраты монооксигеназной системы и продукты их метаболизма с антиоксидантной
175
активностью. Реакции начинали добавлением микросомного
белка в концентрации 1 мг/мл. Действие лекарств тестировали
в этих системах, добавляя каждое вещество в конечной концентрации 0,5 мМ, за исключением ДП, который использовали
в концентрации 0,034 мМ.
Другую популяцию крыс самцов линии Sprague-Dawley
массой 200-250 г использовали в серии экспериментов in vivo
после голодания в течение 18-20 ч для изучения протекторного
действия ДЭКП в условиях CCl4–зависимого гепатогенеза. Такая постановка задачи была важна и потому, что CCl4 часто
используется при разработке моделей действия низкомолекулярных органических загрязнителей окружающей среды.
Одна группа животных получала CCl4 (20% раствор
в подсолнечном масле – v/v в дозе 1 мл на 1 кг массы тела),
другая группа – ДЭКП (20 мг на 1 кг) до введения CCl4. Третья
группа крыс получала отдельно ДЭКП (20 мг на 1 кг). Контрольные крысы получали воду или масло. Все вещества вводили внутрибрюшинно под эфирным наркозом, а через 3 ч животных двух групп забивали. Через 3,5 ч забивали оставшуюся
группу животных, получивших лекарство и CCl4. Печень этих
крыс использовали для получения микросом и тестирования их
по чувствительности к ПОЛ. Все результаты выражали в процентах по отношению к значению начальной точки измерения
(100%). Достоверность получаемых результатов оценивали по
критерию Стьюдента, уровень значимости P не превышал значения 0,005.
2.5. Количество цитохрома Р-450 в микросомах печени
крыс и плаценты человека определяли по методу (Omura and
Sato, 1964). Суспензию микросом помещали в две пробирки, для
восстановления цитохрома Р-450 добавляли несколько кристалликов дитионита натрия (Na
). Одну из пробирок для обра-
2S2O4
зования восстановленного комплекса цитохром Р-450 – СО
в течение 1-2 мин продували СО, получаемым в результате реакции между концетрированными серной и муравьиной кислотами.
Затем регистрировали дифференциальные спектры поглощения
в кювете с длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре
176
в области от 400 до 500 нм. Количество цитохромов Р-450
и Р-420 рассчитывали, используя E, равные для цитохрома
Р-450 – 910 00 М
-1см-1
, а для цитохрома Р-420 – 111 000 М-1см-1.
2.6. Монооксигеназные активности: ЭКОД и ЭРОД изме-
ряли путем регистрации кинетики образования соответствующих производных 7-ОК и 7-ОР прямым флюориметрическим
методом (Ullrich and Weber, 1972). Инкубационная смесь содержала 0,1-0,2 мг микросомного белка, 0,1 мМ ЭДТА, 50 мМ
фосфатного буфера, рН 7,6 при 37˚С. После добавления в реак-
ционную смесь 10 мкл 10 мМ НАДФН регистрировали скорость возрастания флюоресценции при 460 нм, длина волны
возбуждающего света 360 нм, на спектрофлюориметре при постоянном перемешивании и 37˚С. Через 1-2 мин для калибровки в кажду
ю пробу добавляли 10 мкл
0,2 мМ раствора 7-ОК
(или 7-ОР) (2 нмоля) в воде. Скорость реакции выражали
в нмоль 7-ОК (или 7-ОР) в мин на нмоль цитохрома Р-450 на
мг белка.
2.7. Обработку микросом протеазой (трипсином) прово-
-6
дили при концентрациях 10
и 2•10-5 М; протеолиз останавли-
вали ФМСФ.
2.8. Водный раствор фосфолипазы А
(из яда пчелы)
2
(0,175 ед./мг белка) добавляли к суспензии микросом (1 мг/мл)
в среде, содержащей 5 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 5 мМ CaCl
,
2
pH 7,6 и инкубировали в течение 5 мин при 37°С при постоянном
перемешивании, после чего гидролиз останавливали 0,1 мМ
ЭДТА. В основе измерения скорости гидролиза фосфолипидов
фосфолипазой А
методом рН-метрии лежит регистрация под-
2
кисления среды образовавшимися СЖК чувствительным стеклянным рН-электродом. Для регистрации изменения рН в качестве электрода сравнения использовали хлор-серебряный электрод. Среда регистрации содержала 100 мМ NaCl, 5 мМ CaCl
,
2
5мМ HEPES, рН 7,0 при 37°С и 0,5-1,0 мг микросомного белка.
+
Для пересчета Н
в количество накопившихся в процессе гид-
ролиза СЖК использовали величину сдвига на кинетической
177
кривой при добавлении в инкубационную смесь этанольного
раствора олеиновой кислоты (10 мМ). Количество образовавшихся ЛФ рассчитывали из того, что при гидролизе 1М фосфолипида образуется 1М СЖК (ср.мол.масса 300) и 1М ЛФ
(ср.мол.масса 500).
2.9. Фракцию микросом, обогащенную цитохромом
Р-450, получали путем инкубации нативных мембран в 50 мМ
фосфатном буфере рН 7,4 при 37°С с тритоном Х-100 (0,05%
на 1 мг белка) в течение 20 мин при 25°С и повторного центрифугирования при 105 000 g в течение 90 мин при 4°С.
Микросомную фракцию, обогащенную НАДФН-цитохром
Р-450-редуктазой, получали преинкубацией препарата нативных микросом (5 мг/мл) в 50 мМ фосфатном буфере
рН 7,4 при 37°С с добавлением 30% раствора глицерина,
-5
10
М ЭДТА, 0,5% раствора холата натрия и 0,4% раствора
тритона Х-100. Полученный солюбилизат наносили на колонку (2x30 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (Whatman DE-52)
и уравновешивали 10 мин 50 мМ KH
при 37°C), содержащим 20% глицерина, 10
-буфером (рН 7,8
2PO4
-4
М ЭДТА, 10-4 М
дитиотреитола, 0,5% раствор холата натрия и 0,4% раствор
тритона Х-100. Элюировали градиентом КСl от 0 до 0,5 М
в том же буфере.
2.10. Отбирали фракции, содержащие
цитохром
ределяли по комбинированному методу (
пределение проводили спектрофотометрически по скоро-
Это о
с
(Р-450)
НAДФH-
-редуктазную активность, которую оп-
Takashi et al., 1981).
сти восстановления цитохрома с. Регистрировали кинетику его
образования при длине волны 550 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. Инкубационная смесь содержала 0,1 мг/мл
микросомного белка, 60 мкМ цитохрома с, 50 мМ Na фосфатный буфер, рН 7,6 при 25˚С. Реакцию запускали, добавляя
0,5 мМ НАДФН в одну кювету. Активность определяли, используя E
= 19000 М-1см-1 для восстановаленного цитохрома с.
550
178
3. Применение тест-системы на основе монооксигеназных
и конъюгирующих активностей плаценты
для оценки развития желтухи новорожденных
невыясненной этиологии Алтайского региона
3.1. Проводили изучение характера как активностей монооксигеназ (содержание изоформ цитохрома Р-450 в плаценте
и их специфические активности), так и активности ферментов
второй фазы детоксикации ксенобиотиков, осуществляющих их
конъюгацию с глютатионом и глюку
роновой кислотой в пла-
центах рожениц ряда районов Алтайского края. Параллельно
ществлялся контроль за степенью ПОЛ в крови новорож-
осу
денных и рожениц, контроль на мутагенность и канцерогенность содержащихся в плаценте соединений с помощью теста
Эймса (Ames et al., 1973). Этот тест позволил также определять
характер метаболической активации в мембранных системах
цитохрома Р-450. Совокупные данные этой большой работы
были опу
бликованы
в сборнике (Kotelevtsev et al., 1995).
3.2. Использовали методы, непосредственно касающиеся
вовлечения систем детоксикации, связанные с активацией кислорода в НАДФН и цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системе плаценты, с плацентарными УДФ-ГТ и цитозольной S-трансферазы. Для тестирования использовали субстраты ряда изоформ цитохрома Р-450 7-ЭК и 7-ЭР.
4. Методы изучения свободно-радикальных процессов
в микросомной фракции печени рыб
4.1. Разработаны методы получения стабильных препаратов микросом из печени байкальских рыб и исследованы их
свойства (определяли активность НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы, арил-у
глеводород-
гидроксилазы, содержание цито-
хрома Р-450 и т.д.) ( Козлов и др., 1983).
Выловленных рыб по возможности не травмировали, дос-
тавляли их в лабораторию на экспедиционном су
179
дне в специ-
ально оборудованном резервуаре, размещенном на корме с проточной водой. После периода адаптации в аквариумах с проточной водой рыб использовали в экспериментах. В день эксперимента после выдерживания рыб в специальных ваннах
(уже без протока) с затравками сточных вод разных разведений
чередовали вылов экземпляров рыбы из этих ванн с выловом
таковых из ванн с чистой водой.
4.2. Выделение микросомных фракций рыб проводили
следу
ющим образом. Использовали свежевыделенну
ю перфузированную холодным раствором 1,15% KCl печень. В стандартную среду выделения, содержащую ту же концентрацию
KCl, добавляли предварительно специально очищенный от
жирных кислот БСА или фракцию V БСА фирмы «Sigma»
(США) в концентрации 15 мг/мл – для удаления продуктов
гидролиза фосфолипидов фосфолипазами типа А, антиоксидант
-4
ионол (10
добавляли ингибитор протеаз ФМСФ (1мг/мл) и ЭДТА (10
для связывания ионов Са
М) – для предотвращения ПОЛ. Кроме того, в среду
-4
2+
и Fe2+, чтобы предотвратить соот-
М)
ветственно активацию фосфолипаз и ПОЛ. С помощью указанного набора веществ стабильные препараты микросом удавалось получать при обязательном выполнении всех операций на
холоду (от 0 до +4°С).
4.3. Концентрацию цитохрома Р-450 в микросомной
фракции печени рыб определяли методом (Johannesen and de
Piere, 1978). Этот метод позволяет определять концентрацию
общего пула цитохрома Р-450 в микросомных препаратах, выделенных из тканей (например, легкие), которые невозможно
полностью отмыть от гемоглобина. Его присутствие всегда искажает спектр поглощения восстановленного цитохрома Р-450
за счет появления метгемоглобина, если следовать методике
(Om
ura and Sato, 1964),
т.е. пропускать СО через суспензию
микросом после добавления дитионита. Довольно часто аналогичная ситуация возникает при перфузии раствором KCl печени
разных видов рыб, особенно если иметь дело с печенью малого
180
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]