Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
Поскольку доля кислорода, восстанавливаемого в организме животного по одноэлектронному пути, значительна
(не менее 10-30%) (Лукьянова и др., 1982), то и интенсивность
генерации ЭВС должна быть высока. Как отмечалось выше,
за последние несколько десятилетий появился громадный массив данных, свидетельствующих о том, что все без исключения
живые системы и даже их фрагменты, в которых сохраняется
хотя бы какой-то у
слабая люминесценция в биологии
ровень метаболизма, излучают свет (Сверх-
, 1972; Slawinski, 1988), причем способность к его испусканию строго зависит от присутствия кислорода.
Детектируемое чувствительными приборами (в основном
это люминометры, работающие в режиме счета одиночных фотонов), ССИ живых систем дает возможность судить исследователю об энергетическом состоянии этих систем. В большин-
чаев, чем меньше организмы излучают во вне, тем более можно считать их организованными, кооперативными, целостными системами, реализующими ЭВС для выполнения
различных функций, направленных на поддержание гомеостаза
организмов. С другой стороны, учитывая, что детекторы ССИ
такие, как фотоэлектронные умножители (ФЭУ), цифровые
камеры и др. – это «внешние» наблюдатели, то регистрируемая
ими очень слабоинтенсивная, например, близкая к фоновому
у
ровню люминесценция может говорить либо о наличии стру
ктур, хорошо удерживающих в живых системах энергию ЭВС,
либо о значительном снижении потенциальных возможностей
поддерживать жизнедеятельность. Поэтому необходимо использовать дополнительные адекватные методические подходы
для того, чтобы выяснить, на каком у
активности находится
та или иная биосистема.
ровне физиологической
Наиболее интенсивно изучаемыми биологическими источниками ССИ являются активированные нейтрофилы крови,
другие фагоцитирующие клетки или разведенная кровь. Фагоциты реагируют на различные агенты и стимулы химической
121
и физической (например, облучение низкоинтенсивным лазером) природы интенсификацией образования АФК. Этот процесс носит название кислородного взрыва или ОВ и сопровождается слабой ХЛ (Kaever et al., 1992; Bochev et al., 1993;
Stevens et al., 1994). В частности, добавление ЛМ к активированным изолированным нейтрофилам в концентрации 10 мкМ
может вызвать образование 1-100 фотонов в 1 с на 1 клетку.
В присутствии же люцигенина (ЛЦ) интенсивность ХЛ оказывается заметно более низкой (максимальное усиление эмиссии
по сравнению со спонтанным излучением достигается с люминолом (ЛМ) в 10
3
-104 раз, а с ЛЦ – в 102-103).
Различные воздействия на организмы, органы и ткани,
клетки и их структуры могут достаточно разнообразно изменять параметры ССИ. В табл. 8.1 представлен достаточно широкий спектр соединений и воздействий, по-разному модифицирующих ССИ-ХЛ (Allen, 1986).
Таблица 8.1
Воздействия, индуцирующие, усиливающие
и ингибирующие ССИ
Класс соединений
и воздействий
А. Индукторы или
усилители
Неорганические
перекиси
Органические
гидроперекиси
Специфическое
воздействие
Н
2О2
(ROOH)-t бутил
гидроперекиси
перекись кумила
этиловая гидроперекись
122
Клетки и ткани –
источники
люминесценции
Сердце, микросомы
легкие, печень
Гомогенат мозга
Легкие
Класс соединений
и воздействий
Специфическое
воздействие
Продолжение табл. 8.1
Клетки и ткани –
источники
люминесценции
Гипербарическая
оксигенация
Токсины
Стимулы окислительного взрыва
СCl
4
Паракват
Индукторы фагоцитоза
и хемотаксиса
Сперма
N-этилмаалеимид
Тимерсал
Арахидоновая кислота
Линолевая кислота
Экзотетраеновая кислота
Изолированные
гепатоциты
Печень
Легкие
Нейтрофилы
Кровь
Яйцеклетки
Тромбоциты
Тромбоциты
Тромбоциты
Везикулярная железа
Канцерогены Бенз(α)пирен Микросомы печени
Доноры электронов НАДФН Микросомы печени
Истощение ловушек метаболитов
кислорода
Усиление эмиссии
синглетного кислорода
–
O, 1,4-
D
2
диазобицикло[2.2.2]
октан
Изолированные
гепатоциты
Различные ткани
Люминофоры
Акцепторы энергетического переноса
Люминол, люцигенин,
фолазин, ароматические
альдегиды
Фагоциты, кровь,
Грибы
Флуоресцин Грибы
123
Класс соединений
и воздействий
Специфическое
воздействие
Окончание табл. 8.1
Клетки и ткани –
источники
люминесценции
Б. Ингибиторы
Удаление
кислорода
Ловушки метаболитов кислорода
Ловушки синглетного кислорода
Ингибиторы
пероксидаз
Ингибиторы
цитохрома Р-450
Ингибиторы синтеза простагландинов
Нестероидные противовоспалительные средства
, Na2S2O4
N
2
Супероксиддисмутаза
Паракват
Глютатион
Дитиотриэтол
Ионол
Аскорбат
-, фураны(дифенил-2,5
N
3
димпетил)каратен
-CN, SKF-525A
N
3
Индометацин, аспирин
Метилсалицилат
Димеркаптопопанол
Микросомы печени,
легкие, сердце,
печень
Нейтрофилы
Гепатоциты
Легкие,
нейтрофилы,
микросомы печени
Тромбоциты
Нейтрофилы
124
На наш взгляд, наиболее ярко перечисленные феномены
ССИ проявляются в системе цельной крови. У большинства
видов позвоночных животных, а также у ряда видов беспозвоночных важнейшую функцию в поглощении, переносе и передаче органам и тканям кислорода осуществляет кровь. В ней
самой постоянно происходят многочисленные взаимодействия
между клеточными и неклеточными компонентами. Особая
роль в этих взаимодействиях принадлежит эритроцитам и лейкоцитам, между которыми постоянно происходит обмен кислородом и его активация, что было нами показано непосредственно в цельной крови. Кровь – это жидкая ткань, представляющая
собой сложну
ю кооперативную систему и обладающая многи
-
ми присущими только ей функциями, самой существенной из
которых является способность поддерживать гомеостаз организма. В следу
ющей главе будет обсу
жден ряд результатов,
прямо отражающих значение АФК в формировании как ЭВС
в крови, так и различных регуляторных функций.
125
ГЛАВА IX
РОЛЬ АФК
И СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ
В ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КРОВИ
9.1. Роль АФК в регуляции обмена кислорода
в нативной крови человека
Поскольку в живых системах постоянно происходят процессы, приводящие к непрерывному возникновению электронно-возбужденных частиц при развитии свободно-радикальных
окислительных реакций, за счет их энергии в клетке могут осуществляться энергоемкие процессы. Непосредственным резу
татом релаксации ЭВС отдельных молекул
биологических объ-
ль-
ектов, как уже отмечалось, является ССИ.
Основной массив данных в области исследований ССИ
биообъектов был накоплен при изучении ХЛ, сопровождающей
генерацию АФК или ОВ в препаратах очищенных суспензий
нейтрофилов, других фагоцитирующих клеток, составляющих
основную часть белой крови, и в сильно разведенной крови.
Наш опыт показал, что, несмотря на свою высокую оптическу
ю
плотность, неразведенная кровь человека и животных может
быть источником излучения, обусловленного трансформацией
энергии
ЭВС и являющегося результатом вторичных процес-
сов, происходящих в системе цельной крови.
Мы исследовали спонтанное и инициированное активаторами ОВ излучение цельной неразведенной крови человека
в отсутствие и в присутствии усилителей ХЛ – люминофоров:
•-
специфического маркера образования О
ЛЦ (10,10’-диметил-
2
9,9’-биакридин динитрат) или менее специфичного маркера ЛМ
(5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазендиол), позволяющего реги-
126
стрировать процессы неспецифически, с участием многих АФК
•-
, H2O2, OH•, СlO•-) (Kalbhen, 1980; Allen, 1986). При ОВ
(O
2
нейтрофилов люминольное излучение отражает, главным образом, реакцию окисления перекисью водорода хлорид-ионов,
катализируемую миелопероксидазой (Cohen et al., 1983).
Нами впервые показано, что люминесценция неразведенной крови здоровых доноров в присутствии ЛЦ всегда наблюдается без каких-либо дополнительных активаторов и может
быть заметно более высокой, чем в присутствии ЛМ. Исходя из
представлений о специфичности ЛМ и ЛЦ, мы сделали вывод
о том, что в свежей крови здоровых доноров непрерывно обра-
•-
ется O
зу
, а содержание других АФК очень низко.
2
Мы обнаружили, что на параметры ХЛ существенно
влияют состояние здоровья доноров, объем образца, агрегатное
состояние и время хранения крови до начала измерений и др.
Так, например, через 24 ч после получения крови в ней резко
возрастает не только ЛЦ-, но и ЛМ-зависимая ХЛ (ЛЦ-ХЛ
и ЛМ-ХЛ соответственно), у ишемических больных у
ЛМ-ХЛ уже высок в свежей крови (см. ниже).
На наш взгляд,
ровень
анализ ХЛ неразведенной крови позволяет судить не только
о возникновении какой-либо патологии, но и о тонких изменениях в пределах гомеостаза, связанных, например, с влиянием
на организм слабых воздействий, с изменением потребления
кислорода и его обмена и др.
Особого внимания заслу
ж
ивают
методические аспекты ис-
следования люминесценции цельной крови (см. приложение).
Из полученных результатов стало ясно, что при некоторых физиологических состояниях доноров интенсивности ЛМХЛ и ЛЦ-ХЛ могут быть сравнены. В случае же активизации
воспалительных процессов, обострения других патологических
состояний, таких, как ИБС у хронических больных, выявлялась
сильная интенсификация ХЛ неразведенной крови в присутствии ЛМ, которая, как правило, снижалась в результате лечения
(см. подробнее ниже). Подобная интенсификация ЛМ-ХЛ на-
127
блюдалась при разведении крови физиологическим раствором,
а интенсивность ЛЦ-ХЛ резко падала. В этом случае поведение
разбавленной крови похоже на поведение изолированных нейтрофилов в суспензии в присутствии ЛМ или ЛЦ. Как отмечалось выше, последняя всегда слабее выражена у изолированных
нейтрофилов в отличие от ЛМ-ХЛ при активации в этих клетках ОВ (рис. 9.1.1).
Наши наблюдения, по-видимому, свидетельству
о том,
ют
что нейтрофилы в неразведенной крови постоянно продуциру-
•-
ют O
из кислорода, получаемого непосредственно от эритро-
2
цитов, и такое взаимодействие этих важных компонентов цельной крови может меняться при неблагоприятных для организма
условиях, прежде всего связанных с нарушениями потребления
и обмена кислорода. После инициации ОВ в свежей крови зимозаном излучение начинало нарастать как в отсутствие, так и
в присутствии обоих люминофоров. Если вскоре после инициации ОВ в присутствии ЛМ (~ через 10 мин) прекращали доступ
л
воздуха в кровь, эмиссия фотонов резко снижалась и не уве
чивалась
до возобновления доступа воздуха (рис. 9.1.2, a).
и-
Прекращение контакта крови с воздухом после выхода
процесса на стационарную фазу приводило лишь к временному
снижению уровня излучения, которое вновь повышалось почти
до исходного через 5-7 мин (см. рис. 9.1.2, a, б).
Это у
к
азывает на то, что контакт цельной
неразведенной
крови с окружающей воздушной средой необходим лишь для
инициации процесса ОВ, тогда как после выхода на стационарный уровень для его продолжения достаточно кислорода, содержащегося в эритроцитах.
С другой стороны, использование нейтрофилами кисло-
•-
рода эритроцитов для продукции О
требует определенной
2
энергетической «затравки», которая, по-видимому, происходит
сразу при поступлении через легкие в кровь в виде молекулярного кислорода и отрицательных аэроионов из окружающего
воздуха (Чижевский, 1922).
128
3400
ь
2
)
н
a
3000
2600
2200
1800
1400
Имп/0.2 мин
1000
600
200
Люминол (1)
или
Кров
люцигенин (
02 4 6
Время, мин
Имп/0.1 мин
2
1
12000
в
10000
8000
6000
4000
2000
0
Зимозан
24681012
Время, мин
1,4e5
б
1,2e5
1e5
80000
60000
Имп/0.2 мин
40000
20000
1:1
Люминол (1)
Люцигенин (2
0
5101520
Люминол
Люцигени
1:7
1:3
Время, мин
1
2
Рис. 9.1.1. ЛМ-ХЛ и ЛЦ-ХЛ люминесценция в цельной
неразведенной крови человека (а), при ее разведении
физраствором (б); в суспензии нейтрофилов, выделенной
из этой крови с активацией ОВ зимозаном (в).
Конечные концентрации ЛМ и ЛЦ – 0,1 мМ; зимозана – 0,1 мг/мл.
Начальное количество крови – 0,1 мл; количество нейтрофилов
в суспензии – 20 000 клеток/0,1 мл
В целом, эти результаты подтверждают нашу гипотезу
о том, что одной из главных мишеней действия аэроионов воздуха в крови являются нейтрофилы, для каталитической продукции которыми О
малого количества супероксид-анионов из внешней среды.
•-
требуется «затравка» в виде чрезвычайно
2
Если в крови исходно создавали гипоксические условия
(рис. 9.1.3, а), то после доступа воздуха (см. отрезок времени 25 мин) ЛМ-ХЛ сразу резко снижалась, а ЛЦ-ХЛ оставалась на
прежнем уровне или даже несколько возрастала (рис. 9.1.3, б).
В следующие 3 мин в отсутствие доступа воздуха ЛМ-ХЛ не
возрастала, а интенсивность ЛЦ-ХЛ заметно у
С
развитием ОВ после следующего доступа воздуха излучение
129
величивалась.
уже возрастало как в присутствии ЛМ, так и ЛЦ (см. отрезок
времени 8-18 мин). Этот эксперимент еще раз указывает на необходимость первоначальной «затравки» и последующего активного потребления нейтрофилами кислорода, связанного
с гемоглобином в эритроцитах, для поддержания ими определенного уровня генерации О
•-
и, в частности, осуществления
2
развития ОВ. Освобождающаяся в этом процессе высокопотенциальная энергии электронного возбуждения расходуется на
разрыв достаточно прочной ковалентной связи между молекулами кислорода и гемом.
1.4e5
а
1.2e5
1e5
80000
60000
Имп./0,2 мин
Люминол+
зимозан
40000
20000
Аэрация
0
01530
Аноксия
Время, мин
Аэрация
1.4e5
б
1.2e5
1e5
80000
60000
Люминол+
зимозан
Имп./0,2 мин
40000
20000
0
Аэрация
01530456075
Время, мин
Аэрация
Аноксия
Аноксия
Аэрация
Аноксия
Рис. 9.1.2. Влияние отсутствия доступа воздуха на ЛМ-ХЛ
при развитии окислительного взрыва, индуцированного зимозаном,
в неразведенной крови человека. Шприц объемом 2 мл с 1 мл крови
в присутствии люминола (0,1 мМ) и зимозана (0,1 мг/мл)
и 1 мл воздуха над кровью фиксировали в счетной камере
сцинтилляционного счетчика
Известно, что при возникновении гипоксии в тканях,
в том числе в тканях мозга и сердца, может активироваться образование АФК и работа гемоксигеназной системы. При конверсии билирубина из гема гемоглобина под действием гемоксигеназы образуется в незначительных концентрациях СО (это
постоянно происходящий процесс в организме), который, как
было показано, может оказывать модулирующее действие на
NO-cGMP-сигнальную систему и таким образом способствовать усилению мозгового кровообращения при недостатке кислорода, посту
пающего с кровью (Ingi et al., 1996), а также спо
-
130
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]