Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
ляет исключить возможность конкуренции за источники восстановительных эквивалентов между реакциями образования перекисей
липидов и локализованными в НС НАДФН-зависимым ферментом,
участвующим в темновой регенерации родопсина (ретинолдегидрогеназа). Неэффективность НАДН и НАДФН в инициировании
переокисления липидов не связана с ингибирующим действием
СОД, так как при добавлении цианида калия (10
-3
М) – ингибитора
Cu, Zn-содержащей СОД в НС-палочек (Hall and Hall, 1975) не ак-
тивировался процесс ПОЛ.
Но в структурах внутренних сегментов (ВС) палочек сетчатки как минтая, так и лягушки удалось обнаружить по крайней
мере НАДН-зависимый механизм образования О
•-
(рис. 2.1.3.1, в)
2
и ПОЛ. Результаты ингибиторного анализа показали, что в мембранах ВС палочек сетчатки лягушки накопление перекисей липидов тормозится на 40-50% при действии адреналина, норадреналина и комплекса Cu(Tyr)
– акцепторов О
2
•-
. Тушители 1О*2
2
и ловушки ОН – радикалов (ДФИБФ, ДАБЦО и этанол, метанол,
маннит) не вызывают достоверного ингибирования НАДНзависимого переокисления липидов в мембранах ВС. Приводимые ниже данные служат подтверждением этого (табл. 2.1.3.1).
Таблица 2.1.3.1
Влияние различных ингибиторов образования АФК
на накопление продуктов ПОЛ в мембранах ВС палочек лягушки
Добавка
НАДН (контроль) 100
Cu(Tyr)2 60+2,0
Адреналин 50+9,5
Норадреналин 55+7,8
Этанол 109+5,8
Маннит 92+3,1
Накопление МДА,
% к контролю
Эти данные, вероятнее всего, отражают наличие во фракции ВС мембранных структур, способных генерировать АФК:
митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭР), которые
содержат оксидоредуктазные системы.
31
Следует, однако, отметить, что скорость НАДН-зависимого
накопления перекисей во фракции ВС невелика (в среднем
1 нмоль МДА на 1 мг белка в 1 мин) и существенно ниже, чем
в мембранных структурах печени, мозга и скелетных мышц.
Идентификация пиридиннуклеотидзависимой генерации АФК
через регистрацию образования продуктов ПОЛ, однако, может быть
не совсем оправданна. Ведь таковая генерация может происходить на
у
ровне скоростей и количеств, не приводящих к процессу пероксидации жирнокислотных ацилов мембранных фосфолипидов сетчатки
или реализующих эту возможность весьма незначительно (как только что рассмотренный случай ВС сетчатки).
Мы показали, что из всех возможных систем защиты
от АФК и перекисей липидов (СОД, ГПР и витамин Е) в фоторецепторах сетчатки холоднокровных и теплокровных животных (лягушка, бык) наибольшую активность проявляет система
витамина Е (табл. 2.1.3.2, 2.1.3.3).
Из данных, приведенных в табл. 2.1.3.2, видно, что во фракциях НС и ВС палочек сетчатки регистрируется почти одинаковая
активность СОД. Сопоставление активностей этого фермента
в самих ФРМ и в водно-этанольных вытяжках из них показывает,
что СОД в фоторецепторах представлена устойчивым к действию
хлороформа ферментом, содержащим медь и цинк (Kim
результат соответствует данным о полном ингибирова-
Этот
ura, 1952).
нии СОД в НС цианидом (Hall and Hall, 1975). Следует отметить,
что, хотя активность СОД в слое фоторецепторных клеток выше,
чем в сетчатке в целом, тем не менее эти различия в активности не
превышают 15-20%. Удаление фоторецепорных клеток из сетчатки
приводит лишь к небольшому снижению активности фермента
в гомогенате. Эти результаты противоречат данным работы
M.O. Hall и D.O. Hall (1975), обнару
живших 200-400-
кратное превышение активности СОД в НС по сравнению с гомогенатом сетчатки. Такая разница в активности СОД в НС и в сетчатке в целом
представляется крайне маловероятной. Если принять величины
активности СОД в НС такими, то тогда простой расчет показывает,
что на долю белка мембран фоторецепторов должно приходиться
не более 0,25-0,50% от общего количества белка в сетчатке, что не
соответствует многочисленным литерату
рным данным (например,
32
Abrahamson et al., 1974; Fried and Mandel, 1975). Вместе с тем активность СОД в сетчатке, измеренная в наших экспериментах, хорошо совпадает с результатами, приведенными в работе Fried and
Mandel (1975). Таким образом, в сетчатке и ее ФРМ СОД представлена с низкой активностью, близкой к таковой в гомологичной ткани – мозге (Fried and Mandel, 1975), но гораздо более слабая, чем
в органеллах печени и эритроцитах (Fridovich, 1972).
Таблица 2.1.3.2
Активность СОД в мембранах фоторецепторов
и сетчатке лягушки и быка (M+
Объект Активность СОД*
Лягушка:
НС:
мембраны 0,18+0,02
экстракт 0,21+0,01
ВС:
мембраны
экстракт 0,18+0,01
сетчатка 0,17+0,01
сетчатка 0,16+0,01
после удаления фоторецепторов** 0,14+0,02
Бык:
НС:
мембраны 0,15+0,01
экстракт 0,17+0,01
ВС:
мембраны 0,14
экстракт –
m)
* За единицу активности СОД принимали 50% ингибирование ско-
рости образования диформазана из НСТ (в контроле при 560 нм скорость
составляла 0,025 ед. опт.пл. за 1 мин на 1 мг белка при 25°С).
** Содержание родопсина в гомогенате сетчаток до и после процедуры удаления фоторецепторов составляло 0,43+
нмоль родопсина на 1 мг белка соответственно.
33
0,07 и 0,09+0,01
Активность ГПР и глютатионредуктазы (ГР) в НС и ВС
палочек сетчатки лягушки и быка оказалась также крайне низкая (табл. 2.1.3.3), хотя во фракции ВС существенно выше, чем
во фракции НС.
Таблица 2.1.3.3
Активность ГПР, ГР и содержание α-токоферола
в мембранах фоторецепторов лягушки и быка (M+
m)
Объект
Лягушка:
НС 0,28+0,02 0,32+0,04 0,21+0,02
ВС 2,86+0,20 1,50+0,30 0,45+0,07
Бык:
НС 0,74 0,72 0,28+0,03
ВС 1,30 1,32 0,16
*Активность ГПР и ГР выражена в нмоль восстановленного (окисленного) глутатиона за 1 мин на 1 мг белка.
Активность
ГПР*
Активность
ГР*
Содержание
α-токоферола,
мг на 1 мг белка
Не исключено, что измеряемая в НС палочек активность
этих ферментов обязана своим происхождением примесям
фракции ВС во фракции НС, и ГПР-ГР система в самих НС
палочек отсутствует. Этот результат становится вполне ясным,
если учесть, что восстановление глютатиона в редуктазной реакции и, следовательно, регенерация восстановленного глютатиона – субстрата глютатионпероксидазной реакции – является
НАДФН-зависимым процессом, так же как и реакция регенерации родопсина после его обесцвечивания, катализиру
емая мембранно-связанным ферментом ретинолдегидрогеназой в дисках
НС. Это заключение перекликается с подобным выводом о неучастии НАДФН в возможной ферментативной генерации АФК
в мембранах НС из-за конкурентных условий в неизбежной
необходимости регенерации родопсина в сетчатке после акта
восприятия света с помощью ретинолдегидрогеназы.
Следовательно, стационарный у
и перекисей липидов в ФРМ
поддерживается не вышерассмот-
ровень генерации АФК
34
ренными ферментными системами, а α-токоферолом. Это заключение следует из полученных нами данных: витамин Е содержится во фракциях НС и ВС в 5-10 раз больших количествах, чем в митохондриях и микросомах печени, что перекликается с данными Farnsworth and Dratz (1976). Обладая высокой
антирадикальной активностью, α-токоферол является одновременно эффективным химическим и физическим тушителем
синглетного кислорода и с высокой скоростью взаимодействует
с анионрадикалами суперокиси
(Foote, 1976; Terrasa et al.,
2009). Вместе с тем при дефиците витамина Е развивается дис-
трофия сетчатки, сопровождаемая интенсивным накоплением
проду
ктов ПОЛ (Каган и др., 1977). Таким образом, из вышесказанного следует, что в мембранных структурах фоторецепторов нагрузку по генерации АФК, по-видимому, могут нести
НАДН-зависимые ферментные системы оксидазного типа в ВС
и ретиналь, освобождающийся в результате воздействия света
на сетчатку при фотолизе родопсина. Основную же регу
ляторную роль в поддержании баланса АФК в сетчатке играет система
витамина Е.
Все вышеперечисленные данные говорят о высокой степени приспособленности зрительной системы к регуляции баланса между необходимостью аэриру
шенным риском образования излишних
емости сетчатки и повы-
концентраций АФК
в мембранных структурах фоторецепторов. С другой стороны,
обнаруженный нами при нормальных условиях спектр действия
образования в сетчатке продуктов ПОЛ в относительно низких
концентрациях соответственно поглощенной энергии света говорит, вероятно, о необходимости генерации электронного возбуждения для осу
ществления зрительного акта. Может
быть
предложена тест-система, в основе которой будет лежать чувствительность структур сетчатки к факторам окружающей среды, повышающих уровень их пероксидации при нормальном
световосприятии или при значительных интенсивностях поглощаемого сетчаткой света.
Полученные нами более 30 лет назад данные о роли
СР-процессов, инициируемых АФК в сетчатке глаза представителей разных систематических групп животных, остаются
35
и сейчас не опровергнутыми. Те безусловные достижения, которые произошли за последующие годы в области изучения
тонких механизмов функционирования зрительной системы,
в том числе и участия в них АФК, конечно, расширили представления о роли СР-реакций при реализации фоторецепторного акта. Но, как показывает анализ литературы по этому вопросу, за прошедшие годы кардинально новых, а тем более противоположных нашим результатов получено не было. Это касается, например, светоиндуцированного образования липоперекисей в мембранах НС палочек сетчатки (Wiegand et al., 1983;
Ohishi et al., 2006); роли супероксиданионрадикала, синглетно
-
го кислорода, перекиси водорода и в целом процесса ПОЛ
в дегенерации сетчатки, липидных и белковых компонентов ее
мембранных образований (Shvedova et al., 1982-1983; De la Paz
and Anderson, 1992; Zhang et al., 1994); важности повышенной
ненасыщенности жирнокислотных остатков ФЛ мембран фоторецепторов в активации ПОЛ (Guajardo et al., 2002;
Martin et
al.,
2005; Catala, 2011); участия витамина Е и ферментных систем
(СОД, ГР) в защитных и регуляторных механизмах в сетчатке
(Каган и др., 1977; Terrasa et al., 2009).
Примечательно также, что все наши результаты были получены, когда не был еще открыт белок трансдуцин. Эпоха
исследований этого важного, относящегося к классу G-белков,
регу
ляторного компонента светоиндуцируемого каскада превращения циклических нуклеотидов в зрительной системе началась
в 1980-х годах
(Fung et al., 1981; Stryer et al., 1983 и др.) и продолжается до сих пор (Yamazaki et al., 2002). Вероятно, обнаруженные нами и другими авторами процессы активации
СР-состояний в липидах сетчатки играют важную роль в передаче фоторецепторного сигнала. По крайней мере, мы еще
в 1979 году показали, что синтез важных компонентов передачи
этого сигнала – трифосфоинозитидов заметно активиру
световой адаптации фракции
НС палочек. В свою очередь, этот
ется при
синтез зависит от статуса с-GMP, что тоже было показано нами
(Tretjak et al., 1980). И, наконец, как теперь уже хорошо известно, определяющую роль в метаболизме циклических нуклеотидов играет трансду
цин
(Fung et al., 1981), а светозависимая или
36
другого рода активация образования АФК и продуктов ПОЛ
в зрительной системе позвоночных животных существенно
отражается на ее функционировании и оказывает заметное
влияние на формирование фоторецепторного ответа.
2.2. Радиоактивность и свободно-радикальные процессы
в биосфере
2.2.1. АФК при монооксигеназном окислении в ЭР
Микросомная фракция и ее монооксигеназная система,
а также мембранные структуры клеток крови могут быть использованы в качестве биоиндикаторов при анализе таких повреждающих факторов окру
жающей среды, как радиоактивные
и химические загрязнения. На обширной территории бывшего
СССР, к сожалению, можно найти не одну территорию, на которой обнару
живаются как химические загрязнители, так и ра-
дионуклиды.
Одним из таких регионов, в котором нам довелось работать, является юг Алтайского края. Сюда благодаря специфической розе ветров в 1940-1960-е годы проникало радиоактивное
заражение с Семипалатинского ядерного полигона. В Алтайском же крае всегда были сосредоточены предприятия, выбрасывающие в окру
жающую среду токсичные химические отходы
производств. Эти отходы являются индукторами и субстратами
системы цитохрома Р-450 – факторами риска онкологических
и других заболеваний. В частности, в конце 80-х годов и начале
девяностых в этом регионе диагностировалась гемолитическая
желтуха невыясненной этиологии у новорожденных детей.
Другим таким регионом являтся 30-километровая зона
в районе Ченобыльской АЭС. Мы проводили исследования
в пруду-охладителе Чернобыльской АЭС.
Активность монооксигеназной системы фракции печени
белых толстолобиков, которые достигли семилетнего возраста,
после аварии была су
щественно снижена в сравнении
с рыбами
из пруда Шатурской ТЭЦ, выбранных в качестве контрольных.
37
Измерения были начаты в мае-июне 1991 года и продолжались в мае-июне 1992 и 1993 годов. На протяжении этого
периода наблюдали дальнейшее подавление активности монооксигеназной системы печени, несмотря на снижение содержания радионуклидов в тканях исследуемых рыб. Вероятно, что
частичное снижение монооксигеназных активностей может
быть связано с условиями содержания рыб, однако полученные
результаты позволяют предположить, что хроническое облу
ние значительными дозами, как и в случ
ае теплокровных жи-
че-
вотных (работы были выполнены под руководством профессора Ю.Б. Кудряшова), приводило к инактивации монооксигеназной системы толстолобиков.
В параллельных исследованиях монооксигеназных активностей печени молодых (не старше трех лет) рыб различных
видов не выявлено корреляционной зависимости между содержанием
137Cs
в мышцах и скоростью этоксирезоруфин-Одеэтилазной (ЭРOД) активности в микросомной фракции печени. По всей вероятности, у рыб второго и следующих поколений, получивших меньшие дозы облучения, активность монооксигеназ не подвергается ощутимым изменениям. Проведенные исследования позволяют сделать заключение о том, что
монооксигеназная система печени семилетних толстолобиков
из садков пруда-охладителя ЧАЭС значительно ослаблена.
Снижение монооксигеназных активностей, по-ви-димому, наблюдается на протяжении всего периода жизни рыб и, несмотря
на у
меньшающу
юся концентрацию
137
Cs в их тканях, не вос-
станавливается.
Исследование монооксигеназных активностей в тканях
рыб в возрасте 3 лет, отловленных в пруду-охладителе ЧАЭС
и в Киевском водохранилище, не выявило существенной модификации системы цитохрома Р-450 у всех исследованных видов. Скорость микросомного окисления 7-этоксирезоруфина
в значительной степени зависела от вида рыб, но не от концентрации
137
Сs в мышцах. Различия в 3-4 градуса в температурных режимах пруда-охладителя ЧАЭС и Киевского водохранилища не должны отражаться на результатах исследований, по-
38
скольку ранее нами было показано, что в таком градиенте температур монооксигеназная активность печени разных видов
рыб существенно не изменяется. Следовательно, сравнение
монооксигеназных активностей у рыб пруда-охладителя ЧАЭС
и Киевского водохранилища вполне правомерны. Из полученных результатов видно, что, несмотря на значительное различие в содержании
137
Cs в мышцах этих рыб, монооксигеназные
активности вполне сравнимы. Это позволяет сделать вывод о
том, что у рыб второго и третьего поколений, родившихся от
производителей, находившихся во время аварии в прудуохладителе ЧАЭС, и у рыб Киевского водохранилища, обитающих вблизи села Страхолесье, скорость ЭРOД не модифицирована.
Исследование генотоксичности экстрактов из печени
и мышц рыб в тесте Эймса сальмонелла/микросомы показало,
что на территории, пострадавшей от аварии на ЧАЭС, кроме
радиационного имеются и другие факторы, способные проявлять тератогенное и мутагенное действие. К ним относятся техногенные загрязнители химической природы. Анализ генотоксичности экстрактов тканей рыб проводили не только с целью
определения присутствия в тканях гидрофобных органических
соединений, способных вызывать генные мутации и, следовательно, влиять на возникновение у
родств при развитии потомства толстолобиков, но и для выяснения возможности совместного действия накапливающихся в тканях органических мутагенных соединений
и радионуклидов на состояние монооксиге-
назной системы рыб, осуществляющей детоксикацию и метаболическу
ю активацию
ксенобиотиков.
Из девяти обследованных видов рыб в печени восьми
и мышцах девяти видов рыб, обитающих в пруду-охладителе
ЧАЭС, регистрировались на обоих тестерных штаммах как
прямые, так и промутагенные соединения. Частота обнаружения мутагенных эффектов в этом водоеме достаточно высока по
сравнению с Киевским водохранилищем. В тканях этих же видов рыб из Киевского водохранилища у
далось обнару
жить
прямые мутагены только в экстрактах печени карпа и в мышцах
39
карпа и леща, а промутагенные соединения – в печени и мышцах леща. Печень и мышцы карпов и толстолобиков из прудаохладителя Шатурской ТЭС также накапливались мутагенные
и промутагенные соединения обоих типов (штаммы ТА 98,
ТА 100). Полученные результаты позволили сделать вывод,
что в таких техногенных водоемах, как пруды-охладители АЭС
и ТЭС, мутагены накапливались у разных видов рыб в значительных количествах. Многие из них представлены прямыми
мутагенными соединениями, которые в большинстве слу
после метаболизма в ус
ловиях детоксикации in vitro (+МА) те-
чаев
ряют или снижают свою генотоксичность. Промутагенные соединения были обнаружены только в экстрактах печени густеры (пруд-охладитель ЧАЭС) и печени лещей (Киевское водохранилище, село Страхолесье). В мышцах рыб по сравнению
с печенью наиболее часто регистрируемые прямые мутагенные
соединения (+МА) обычно в меньшей степени подвержены
метаболическим превращениям, и их генотоксичность не снижается в результате метаболической активации. По-видимому,
это связано с тем, что мышцы рыб являются «вторичным депо»
мутагенов, которые сначала накапливаются в печени, а затем
в ходе метаболизма попадают в мышцы, где их концентрация
через определенное время достигает значимого у
ровня. Одной
из причин накопления значительных количеств мутагенных
соединений
в тканях рыб пруда-охладителя ЧАЭС является
возможное ослабление системы детоксикации печени хроническим радиационным облучением.
Это предположение подтверждается тем, что в тесте Эймса после метаболизма в присутствии крысиной S9-фракции
(система метаболической активации) большинство прямых мутагенов экстракта мышц у
трачивает или ослабляет
свою мута-
генную активность. Кумулятивный эффект мутагенных ксено-
биотиков и радиационного облучения в этом водоеме может
приводить к снижению плодовитости рыб и появлению
уродств при развитии потомства.
Накопление в тканях рыб генотоксических соединений, как
и других ксенобиотиков (включая тяжелые металлы), может оп-
40
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]