Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
Несмотря на возникающие сложности в оценке механизма
действия ДЭКП как «метаболического» антиоксиданта и протектора в отношении действия ССl
на микросомную систему
4
in vitro, можно было полагать, что это лекарство целесообразно
использовать не только в качестве ингибитора освобождения
гистамина и лейкотриенов в клетке (Ford-Hutchinson, 1985;
Joseph and Dixon, 1984) но и как профилактическое средство
против токсического действия гепотоксикантов in vivo.
Чтобы подтвердить это предположение, была проверена
устойчивость мембран микросом, полученных из печени крыс,
подверженных действию ССl
2+
Fe
-АДФ-НАДФН-зависимого ПОЛ.
и ДЭКП (рис. 4.4), к индукции
4
Эта система индукции ПОЛ позволила не только установить степень стабильности микросом, но и оценить целостность
монооксигеназной системы после развития процесса ПОЛ, индуцированного ССl
микросом из печени крыс, подвергавшихся действию ССl
in vivo. Как показано на рис. 4.4, мембраны
4
, ока-
4
зались весьма чувствительными к НАДФН-зави-симому ПОЛ,
причем в первые 10 мин скорость этого процесса была высокой.
Общее содержание МДА в этих мембранах было существенно
выше, чем в контрольных микросомах через 60 мин после начала индукции ПОЛ in vitro, однако в первые 10 мин скорости
образования продуктов ПОЛ отличались незначительно, что
может говорить не столько о повреждении белковых компонентов электронтранспортной цепи микросом, сколько о дезинтегрированности самого липидного бислоя после действия ССl
4
in vivo, где могли образовываться свободно-радикальные центры, ГП фосфолипидов, облегчающие впоследствии реакции
ПОЛ in vitro. По-видимому, можно достичь таких сроков воздействия гепатотоксина, когда в монооксигеназной системе
и в целой печени произойдут уже необратимые деструктивные
изменения. Введение животным ДЭКП совместно с ССl
значи-
4
тельно стабилизировало микросомные мембраны (см. рис. 4.4,
кривые 2, 3). Введение ДЭКП контрольным животным приводило к тому, что устойчивость мембран микросом к ПОЛ стано-
71
вилась выше, чем интактных микросом (см. рис. 4.4, кривые 1, 4).
Таким образом, ДЭКП надежно защищает организм от действия
, является хорошим стабилизатором микросомных мем-
ССl
4
бран, а продукты его метаболизма в монооксигеназной системе,
вероятно, обладают антиокислительными свойствами. Другие
исследованные лекарства также были оценены по их антиокислительной активности, которая у левамисола оказалась слабой,
у ЛБ практически отсутствовала и только ДП оказался сильным
антиоксидантом прямого действия.
Итак, микросомная фракция печени крыс может быть
хорошей тест-системой для оценки антиокислительной активности лекарственных веществ разнонаправленного действия, при этом она позволяет учитывать их возможную метаболическую детоксикацию и метаболическую активацию.
72
ГЛАВА V
БИОХИМИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ЭКОСИСТЕМ
НА ОСНОВЕ МОНООКСИГЕНАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ
В МЕМБРАНАХ ЭНДОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО
РЕТИКУЛУМА РЫБ
5.1. Монооксигеназы со смешанной функцией
в микросомах печени рыб озера Байкал
На протяжении более чем 10 лет (1980-1993 гг.) мы проводили исследования на оз. Байкал активности монооксигеназ
в печени различных видов рыб, включая эндемиков на базе Института
экологической токсикологии в г. Байкальске. Директор
и основатель первого в нашей стране института Экологической
токсикологии А.М. Бейм, участник и вдохновитель всех наших
исследований на Байкале, скончался в 1995 году.
Мы изучали действие сточных вод Байкальского целлюлозно-бумажного комбината (БЦБК) на структурно-функциональные свойства оксигеназ со смешанной функцией в микро
-
сомах печени разных видов байкальских рыб: омуля (Coregonus
autumnalis migratorius), хариуса (Thymallus arcticus baikalensis),
ленка (Brachymystax lenok), сига (Coregonus lavaretus baikalensis),
ельца (Leuciscus leuciscus baikalensis), плотвы (Rutilus rutilus
lacustris), гольяна (Phoxinus percnurus), окуня (Perca fluviatilis)
и эндемичных бычков – желтокрылки (Cottocomephorus
gremingki) и подкаменки (Batrachocottus baikalensis) в течение
летне-осеннего периода (июль–октябрь) как in vivo, так и in vitro.
Одной из больших трудностей работы с микросомными фрак
-
циями печени рыб является высокая их лабильность, требующая разработки специальных методов получения неповрежденных препаратов микросом, обладающих высокой ферментативной активностью. Эта лабильность мембранных структур печени у рыб обусловлена, по крайней мере, тремя факторами:
1) высокой ненасыщенностью мембранных фосфолипидов
73
и вследствие этого подверженностью ПОЛ; 2) высокой активностью фосфолипаз (особенно типа А); 3) высокой активностью
протеолитических ферментов. Ясно, что стабилизация мембранных препаратов должна учитывать все возможные источники повреждения мембранных структур печени.
Мы достаточно подробно изучили количественное соотношение ферментных компонентов монооксигеназной системы
и их активность. Приводим таблицу, содержащую данные по
этим параметрам (табл. 5.1.1). Активность начального компонента системы оксигеназ со смешанной функцией фермента
НАДФН-цитохром Р-450-реду
цию супероксиданионрадикала, определяли по скорости
ктазы, ответственного за генера-
вос-
становления экзогенного цитохрома с (Williams and Kamin,
1962). Из данных, представленных в табл. 5.1.1, видно, что активность этого фермента у изученных видов рыб существенно
колеблется, но не превышает 2,5 нмоля цитохрома с на 1 мг
белка в 1 мин, т.е. очень низка (в 50-100 раз меньше, чем в микросомной фракции теплокровных животных).
Содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени байкальских рыб оказалось гораздо ниже (в 5-10 раз), чем содержание цитохрома Р-450 в микросомах представителей морской
ихтиофауны (Chambers and Yarbrough, 1976), а тем более теплокровных
животных.
Необходимо отметить, что если в свежевыделенных микросомах печени теплокровных животных цитохром Р-420 практически отсутствует, то в микросомах печени рыб он все-таки
обнаруживался, несмотря на все меры предосторожности, предпринимаемые при выделении
. Возможно, что эта неактивная
форма цитохрома Р-450 присутствует в печени рыб in vivo и соответствует естественному уровню катаболизма
гемопротеида.
В табл. 5.1.1 также представлены данные о содержании
цитохрома b
. Его количество заметно превышает содержание
5
цитохрома Р-450 и приближается к значениям, полученным для
других морских и пресноводных рыб (Ahakes et al., 1977).
74
Активность НАДФН-цитохром Р-450-редуктазы,
содержание цитохромов Р-450 и b
печени рыб озера Байкал
в микросомной фракции
5
Таблица 5.1.1
Активность
Вид рыб
Гольян (n=3) 2,49+0,99 0,08 0,07 0,04
Окунь (n=13) 0,60+0,20 0,19+0,07 0,20+0,14 0,40+0,06
Плотва (n=14) 1,17+0,31 0,18+0,05 0,12+0,04 0,21+0,05
Хариус (n=15) 0,61+0,01 0,32+0,07 0,08+0,01 0,40+0,06
Омуль (n=15) 0,58+0,07 0,37+0,07 0,07+0,01 0,42+0,05
Сиг (n=12) – 0,28+0,06 – 0,35+0,07
Ленок (n=15) – 0,24+0,05 0,05+0,01 0,34+0,04
Бычок подкаменка
(n=21)
Бычок желтокрылка
(n=21)
редуктазы,
нмоль цит.
-1
с•мг
•мин-1
– 0,11+
– 0,12+
Содержание цитохромов,
нмоль на 1 мг белка:
P-450 P-420 b
0,02 – 0,22+0,04
0,03 – 0,21+0,05
5
Известно, что система оксигеназ со смешанной функцией
является индуцибельной, т.е. активируется при действии гидрофобных ксенобиотиков. Существует точка зрения, что активность системы оксигеназ со смешанной функцией отражает уровень загрязнения среды гидрофобными ксенобиотиками. Озеро
Байкал – один из наиболее чистых водоемов. Поэтому обнаружение относительно низких концентраций цитохрома Р-450
и НАДФН-цитохром Р-450-реду
оз. Байкал (ому
ля, хариуса), выловленных в разных его районах,
ктазы в микросомах печени рыб
с одной стороны, является следствием исключительно низкого
содержания в воде озера индукторов НАДФН-зависимой системы детоксикации, а с другой – позволяет считать выявленный
уровень развития системы оксигеназ со смешанной функцией
конститутивным, используемым главным образом для метаболизма эндогенных су
бстратов с образованием стероидных гор
-
монов и желчных кислот. В пользу этих аргументов говорит
и значительно более высокое содержание цитохрома b
(по срав-
5
75
нению с цитохромом Р-450) в микросомах печени байкальских
рыб, поскольку известно, что цитохром b
не индуцируется гид-
5
рофобными загрязнителями (Bend et al., 1977).
Другим подтверждением этого является обнаруженная
нами исключительно низкая активность БП-гидроксилазы,
не превышающая 0,5 пмоля фенольных продуктов метаболизма
БП на 1 мг белка в 1 мин. Это в 50 раз ниже соответствующей
активности, характерной для печени теплокровных, и в 10 раз –
для печени морских рыб.
Проведенное исследование позволяет также заключить,
что тест-системы, основанные на определении активности микросомной фракции печени рыб можно рекомендовать как высокочувствительные тесты для оценки степени загрязненности
пресноводных водоемов органическими соединениями, способными индуцировать монооксигеназную систему и АФК.
Кроме того, по-видимому, с помощью такой тест-системы
возможно определять пороги чувствительности к ксенобиотикам различных видов
рыб и птици, возможно, других животных, так как низкий конститутивный уровень содержания
и активностей компонентов монооксигеназ печени может быть
по разному чувствительным к незначительным превышениям
концентраций загрязнителей в окружающей среде. Рассмотрим
теперь способность монооксигеназной системы печени байкальских рыб подвергаться индукции разными классами ксенобиотиков с целью выявления преимущественных
изоформ ци-
тохрома Р-450 и монооксигеназных активностей.
5.2. Иммунохимический анализ индукции
изоформ цитохрома Р-450 в печени пресноводных рыб –
эффективная тест-система на воздействие
полициклическими ароматическими углеводородами
и полихлорированными бифенилами
О множественных изоформах цитохрома Р-450 печени
рыб было накоплено весьма незначительное число фактического материала ко времени наших исследований на озере
Байкал.
76
Различные изоферменты были выделены из тканей только трех
костистых рыб: трески, скапа, форели и хрящевой рыбы маленького ската (Stegeman and Kloepper-Sams, 1987). Оставалось
невыясненным, какие классы цитохромов индуцируются в печени рыб и как это зависит от вида рыб. Между тем исследование монооксигеназ печени рыб представляет особый интерес,
поскольку на основе этих данных можно разрабатывать тестсистемы для эколого-токсикологического анализа окру
жающей
среды, проведения биомониторинга и биотестирования (Котелевцев и др., 1986;
Котелевцев, 2010). Проблемы метаболизма
чужеродных соединений в тканях рыб важны для решения задач контроля окружающей среды и имеют значение для рыбного хозяйства в связи со стремительным ростом онкологических
заболеваний рыб как в мировом океане, так и в рыбохозяйственных водоемах (в том числе при искусственном разведении)
(Котелевцев и др., 1986).
Проводили оценку изоформенного состава пула цитохрома Р-450 у байкальских рыб и определение их ферментативной
активности с помощью ингибиторного анализа специфическими антителами и су
бстратов О-
деалкилирования.
Содержание цитохрома Р-450 и монооксигеназные активности микросом печени рыб зависят от их пола, периода репродуктивности и вида (Котелевцев и др., 1986).
В микросомах печени байкальских рыб, в отличие от микросом печени карпов, полу
чаемых из подмосковных рыбных
хозяйств, очень низкий уровень ЭКОД и ЭРОД, если измерения
проводить без предварительной индукции монооксигеназ МХ
или арахлором (АХ). Тем не менее микросомы, выделенные из
печени не индуцированных ксенобиотиками байкальских рыб,
способны осу
ществлять метаболизм этих су
бстратов. Контрольные антитела и антитела к цитохрому CYT2B1 не оказывают достоверного влияния на все изученные нами монооксигеназные активности. Анализ фракции микросом печени подвергавшихся и неподвергавшихся действию МХ и АХ рыб,
проводившийся с помощью двойной иммунодиффузии по ме-
77
тоду Оухтерлони, не выявил взаимодействия изоформ цитохромов рыб с антителами на изоформы цитохрома Р-450 крыс
(рис. 5.2.1.1).
и иммуноглобулина (3) на ЭКОД в микросомах печени хариуса
Рис. 5.2.1.1. Влияние поликлональных антител
к цитохрому CYT1A1 (1), антител к CYT2B1 (2)
после воздействия АХ (а) и НФ (б)
По-видимому, данный метод не обладает достаточной
чувствительностью, а изоформы цитохромов рыб не имеют
необходимого количества родственных антигенных детерминант с цитохромом Р-450 крыс, которые позволили бы анализировать их методом двойной иммунодиффузии с помощью антител к изоформам Р-450 крыс.
Вильямс и Бухлер (Williams and Buhler, 1983) получили
изоформу CYT1A1 из печени форели после воздействия нафтофлавона (НФ) и провели сравнение этой изоформы с изоформой Р-450 из печени крыс после такого же воздействия. В ре-
78
конструированной системе антитела против изоформы Р-450
крыс не ингибировали бенз(α)пирен (БП) – гидроксилазную
активность монооксигеназы печени форели. Кроме того, эти
авторы не выявили иммунологической идентичности индуцированных НФ изоформ цитохрома Р-450 крыс и рыб с помощью
метода Оухтерлони. Тем не менее между изоформами цитохрома Р-450 печени крыс и рыб, индуцируемыми ПАУ, есть
функциональная и стру
ктурная
идентичность.
Были получены поликлональные антитела против
CYP1A1 скапа (Stegeman et al., 1985), против CYT1A1 трески
(Stegeman and Kloepper-Sams, 1987). Против CYP1A1 скапа по-
лучены моноклональные антитела (Stegeman et al., 1985;
Kloepper-Sams et al., 1987). Все эти изоформы родственны изо-
ферменту CYT1A1 крыс, индуцируемым в печени ПАУ ряда
МХ и НФ. Стегеман с сотрудниками (Stegeman et al., 1985) методом иммуноблота показали, что поликлональные антитела
против цитохрома Р-450 скапа, индуцированного НФ, взаимодействуют с рядом микросомных белков, в то время как моноклональные антитела взаимодействуют строго с полосой цитохрома Р-450 Е в микросомах различных видов рыб, индуцированных НФ, и с CYT1A1 крыс. Таким образом, эти результаты
согласу
ются с нашими данными и позволяют утве
рждать, что
как ПАУ типа МХ, так и ПХБ индуцируют в микросомах печени рыб разных видов иммунологически родственные изоформы
цитохрома Р-450, имеющие сродство к антителам, полу
к CYT1A1, но не
к CYT2B1 крыс.
чаемым
Антитела против CYT1AI крыс могут быть успешно использованы для иммунологического анализа микросом рыб,
подвергавшихся воздействию ПАУ и ПХБ.
Индукция изоформ цитохрома Р -450 происходила и при
затравке рыб сточными водами БЦБК, но достоверные отличия
в изменениях монооксигеназных активностей насту
месяц инкубации рыб в очищенных сточных водах, раз-
через
пали лишь
веденных до 20% от своего исходного состояния.
79
5.3. Изучение ферментных и неферментных систем ПОЛ
в микросомах печени рыб озера Байкал
Как уже хорошо известно, а также показано в ряде наших
экспериментов, в мембранных структурах теплокровных животных рассматриваемая НАДФН-зависимая электронтранспортная цепь катализирует диоксигеназные реакции ПОЛ (Владимиров и Арчаков, 1972 и др.), являющиеся механизмами регуляции активности системы оксигеназ со смешанной функцией in vivo, разборки цитохрома Р-450 и обновления мембранных
фосфолипидов (Каган и др., 1974; Каган и др., 1984 и др.). Наличие систем генерации АФК и перекисей липидов в микросомах печени рыб и регу
ляторное воздействие на активность системы оксигеназ со смешанной функцией могло бы существенным образом определять эффективность детоксикации
фобных загрязнителей, попадающих в окру
(Deér et al., 2010). Изучение ферментных
жающу
и неферментных сис-
гидро-
ю среду
тем генерации АФК и ПОЛ в мембранах ЭР печени рыб озера
Байкал до нас не проводилось, поэтому результаты наших исследований тех лет остаются значимыми до сих пор.
Мы исследовали ферментные и неферментные системы
инициирования реакций ПОЛ в микросомных фракциях печени
рыб оз. Байкал и действие на них одно- и многоатомных фенолов – компонентов сточных вод целлюлозно-бу
ната. Проанализиру
ем данные этих исследований с точки зре-
мажного комби-
ния пригодности их использования как тест-параметров, характеризующих эффективность реакции монооксигеназной системы печени байкальских рыб на загрязнители – индукторы цитохром Р-450-зависимого ферментативного комплекса или процесса ПОЛ, а также возможных антиокислительных свойств
подобных загрязнителей или продуктов
их метаболизма.
Результаты исследований показали, что в присутствии ионов двухвалентного железа и источников восстановительных эк-
-5
вивалентов (НАДФН и НАДН) в концентрациях 10
М и 5•10-5 М
соответственно в микросомных фракциях печени рыб накаплива-
80
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]