Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
в регуляции жизненно важных функций, связанных, в частности, с работой гемсодержащих белков, таких, как гуанилатциклаза, цитохром Р-450, гемоглобин (Ingi et al., 1996; Maulik et al.,
1996; Otterbein, 2002). Важное значение имеет тот факт, что
в митохондриях на определенном этапе сложного процесса
окислительного фосфорилирования образуется супероксиданион
радикал кислорода, а затем и перекись водорода (Boveris et al.,
1976; Skulachev, 2002). Их образование в митохондриях осуществляется в ус
ловиях высокой степени восстановленности переносчиков дыхательной цепи, и ответственными за этот процесс считаются НАДН-дегидрогеназа и убихинон. Максимальная активация О
происходит в присутствии сукцината.
2
Подвергаться активации кислород может не только в митохондриях, но и при различных условиях и в разных средах.
При решении этой проблемы важна сравнительная оценка
свойств и механизмов действия АФК на биологические структуры и процессы, диагностика, тестирование и корректировка
состояния живых объектов при их отклике на воздействие факторов окру
жающей среды на всех у
ровнях биологической организации. Основа всех этих проявлений заключается в инициации АФК различных жизненно важных или патологических
процессов. Главную роль здесь играет супероксиданион радикал как первоначальный продукт одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. Кроме того, что этот радикал
кислорода в своей гидратированной форме содержится в незначительных количествах в воздухе в виде так называемых отрицательных аэроинов (Чижевский, 1922). Как оказалось, без этого, хотя по концентрации и ничтожно малого (500 таких ионов
3
в см
в 10
воздуха против содержания кислорода в том же объеме
16
раз больше!), но очень важного фактора окружающей
среды, невозможна жизнедеятельность (Чижевский, 1922;
Kondrashova et al., 2000; Гольдштейн, 2002).
Таким образом, реакции с участием АФК в живых системах могут быть основой для оценки различных изменений физиологического состояния, в том числе и после воздействия
11
внешних факторов как физической (свет, ионизирующее облучение, электромагнитые поля, температура), так и химической
природы.
1.2. Системы, способствующие генерации АФК
и других свободных радикалов
Здесь следует сказать об определяющей роли любых биомембран, не только митохондриальных, – это их энергетическая
функция: при постоянно генерируемом уровне пероксидации
жирнокислотных цепей фосфолипидов (ФЛ) создается лабильный фонд ЭВС в фосфолипидном матриксе мембран. В литературе есть у
казания на такую возможность (Dm
itriev, 2001).
Фонд ЭВС обеспечивается постоянной генерацией АФК, образованием ГП липидов, алкильных и алкоксильных радикалов,
вторичных продуктов ПОЛ карбонильной природы. Преобразования АФК и свободно-радикальных состояний в биомембранах позволяют осуществлять триггерные энергетические «посылы» для выполнения регу
ляторных функций, свойственных
сложной мозаике мембранных компонентов. В частности, активирование реакций де- и реацилирования с участием фосфолипаз типа А может происходить эффективно только при условии
наличия в жирнокислотных остатках ФЛ возбужденных алкильных или алкоксильных радикальных состояний, перекисных группировок. Однако, по мнению ряда авторитетных ученых, О
•-
представляет собой побочный, нежелательный про-
2
дукт как цикла Кребса, так и других биохимических процессов
(Голубев, 1996). От супероксиданион радикала и образующихся
далее других АФК, как считают, клетке необходимо избавляться, чтобы не получить пагубных последствий. Такая точка зрения сложилась на основе большого фактического материала,
указывающего на то, что АФК, генерация которых неизбежна
в клетках и тканях организма, запу
радикальные реакции
, приводящие к химической модификации
скают цепные свободно-
важных биологических структур. Основным таким процессом
считается ПОЛ, радикальные и молекулярные продукты кото-
12
рого обладают выраженным повреждающим действием, нарушающим нормальный метаболизм и приводящим к развитию
патологических состояний (Beckman and Ames, 1998; Liochev
and Fridovich, 1999).
К сожалению, теперь большинство исследователей редко
обращаются к сочинениям крупного русского биохимика Алексея Николаевича Баха, который более 100 лет назад (Бах, 1897)
впервые указал на важную роль образования перекисных соединений в процессах медленного окисления различных веществ неорганического и органического происхождения, в том
числе и в живых системах. Одновременно, но независимо от
него, перекисную теорию окисления предложил немецкий химик К.О. Энглер. С тех пор эта теория носит имя Баха–Энглера.
В последу
эту теорию. Одна из его главных заслу
уже в своих
ющих своих работах А.Н. Бах продолжал развивать
г состоит в том, что он
первых
работах на тему химизма дыхательных
процессов придавал основополагающее значение активированному кислороду в нормальном метаболизме пищевых веществ
(Бах, 1912).
Список дальнейших работ разных авторов и школ, охватывающий свободно-радикальные (СР) процессы, проблему
пероксидации липидных компонентов клеточных мембран,
очень большой, трудно даже установить приоритет какой-либо
из них в изучении основополагающих закономерностей протекания процесса ПОЛ в живой клетке.
1.3. Субстраты свободно-радикальных реакций
и методы определения продуктов их взаимодействия
Субстратами ПОЛ в живой клетке прежде всего являются
ненасыщенные жирные кислоты как основные компоненты ФЛ,
осуществляющих структурно-функциональную организацию
биологических мембран (Козлов, 1977; Болдырев, 1985; Кагава,
1985). Помимо ненасыщенных жирных кислот субстратами
СР-реакций могут быть нуклеиновые кислоты и белки. Не представляется возможным обсудить здесь все многочисленные ре-
13
зультаты исследований в этой области, но следует сказать о пионерских работах школы профессора Б.Н. Тарусова (Перелыгин
и Тарусов, 1966; Тарусов, 1972; Журавлев, 1972 и др.), последователи которой много сделали для понимания механизмов свободно-радикальных реакций в живых организмах как в условиях нормальной жизнедеятельности, так и при развитии различных патологических состояний. Мы останавливаемся на этих
работах в первую очередь потому, что на первой в мире кафедре биофизики Московского у
ру
совым, с середины 50-х годов XX столетия начало развиваться
ниверситета, основанной Б.Н. Та
-
направление исследований сверхслабых излучений (ССИ) биологических объектов. Именно здесь впервые удалось зарегистрировать эти излучения в видимом диапазоне электромагнитного
спектра с помощью особо чувствительной аппарату
ванной на регистрации
одиночных
фотонов фотоэлектронными
ры, осно-
умножителями (ФЭУ). Эти ССИ являются результатом свободно-радикальных процессов в клетках и тканях живых организмов, и как было показано в исследованиях школы Б.Н. Тарусова,
под воздействием ионизирующей радиации, опухолевого роста
и некоторых других патологических процессов повышается интенсивность излучения, и основным су
за него, являются ФЛ клеточных мембран
бстратом, ответственным
. Именно в этих компо-
нентах клетки и протекают процессы ПОЛ.
На сегодняшний день разработано достаточно большое
количество методов, позволяющих регистрировать образование
АФК, различных продуктов их взаимодействия с клеточными
структурами, другими субстратами молекулярного и надмолеку
лярного происхождения. Изучение реакций ПОЛ с использо
-
ванием различных методов и в разнообразных объектах получило развитие на кафедре биофизики в созданной профессором
Ю.П. Козловым лаборатории физико-химии биомембран, в которой и были проведены все составляющие основу настоящей
книги работы. Ряд успехов в изучении ПОЛ удалось достигнуть
благодаря применению метода привитой сополимеризации,
который оказался очень чувствительным и позволял обнару
вать свободно-
радикальные продукты в клетках и тканях в еще
жи-
14
незначительных концентрациях, например, на начальных стадиях развития лучевого поражения, канцерогенеза (Козлов,
1970), что было недоступно другим методам. В этой лаборатории изучали различные механизмы протекания ПОЛ в мембранных образованиях зрительной, нервной, мышечной систем
(Kagan et al., 1973; Елуашвили и др., 1978), свободнорадикальные реакции в тканях при радиационном поражении
организма животных, канцерогенезе, злокачественном росте
и других патологических процессах при одновременном сочетании разных методов in vivo и in vitro (Данилов и др., 1972;
Козлов и др., 1972; Каган и др., 1973), а также под влиянием
повреждающих и загрязняющих факторов окру
приводящих к интенсификации
ПОЛ (Козлов и др., 1984;
жающей среды,
Бейм и Новиков, 1987) и т.д. При этом, наряду с упомянутыми
методами регистрации сверхслабой люминесценции и привитой
сополимеризации, в лаборатории применяли другие адекватные
методы обнаружения свободных радикалов и проду
в тканях, клетках
и мембранных образованиях. Основными из
ктов ПОЛ
них были радиоспектроскопия, спектрофото- и флюориметрия,
хемилюминесценция [регистрация диеновых и триеновых
конъюгатов в липидных фракциях биомембран (Bolland and
Koch, 1945), шиффовых оснований (Bidlack and Tappel, 1973)],
определение концентрации ГП с помощью полярографии
с рту
тно-капельным электродом (Данилов и др., 1972), определение содержания молекулярного продукта ПОЛ – МДА
(Kohn and Liversedge, 1944) и др. (см. приложение).
Далее следует остановиться на исследованиях в области
свободно-радикальных процессов школы академиков Н.Н. Семенова и Н.М. Эмануэля в стенах института Химической физики АН СССР (ныне Институты Химической и Биохимической
физики РАН). Особенно примечательны работы под ру
дством члена-корреспондента РАН
, профессора Е.Б. Бурлако-
ково-
вой, посвященные раскрытию механизмов, ответственных за
образование и трансформацию АФК, продуктов ПОЛ, за регуляцию свободно-радикальных процессов на разных уровнях
организации живого (Бурлакова и др., 1965; Burlakova et al.,
15
1980; Burlakova et al., 1998 и др.). Наибольший интерес пред-
ставляют работы, выполняющиеся под руководством Е.Б. Бурлаковой в течение последних нескольких лет и связанных
с влиянием малых и сверхмалых доз веществ антиоксидантной
природы на протекание свободно-радикальных и ряда других
реакций, в частности, определяющих пути генерации и трансформации АФК и продуктов ПОЛ в организме (Palm
1997; Maltseva et al., 1998 и др.). Гру
ппа ученых под руково-
na et al.,
i
дством Н.М. Эмануэля и Б.Н. Тарусова за цикл работ «Физикохимические механизмы свободно-радикального ПОЛ в биологических мембранах (1954-1981)» в 1983 году была удостоена
Государственной премии СССР.
Безусловно, работами других отечественных ученых и зарубежных исследователей также внесен значительный вклад
в выяснение механизмов протекания и проявления реакций
с у
частием АФК в жизнедеятельности организмов.
К сожалению, не все исследователи уделяли должное
внимание именно регулирующей роли антиоксидантных систем
в свободно-радикальных окислительных процессах. Действительно, ведь не только для полной элиминации «вредных» продуктов реакций свободно-радикального окисления они, вероятно, существуют, но и для поддержания динамического баланса,
необходимого концентрационного у
ровня и скорости
генерации
тех же АФК.
1.4. Системы, регулирующие свободно-радикальные
процессы – антиоксиданты
Помимо систем, продуцирующих АФК, природа предусмотрела такие ферментные и неферментные защитные механизмы, которые регулируют процессы образования АФК и свободных радикалов в клетках, тканях и организме, осуществляя
в целом антиоксидантные функции (Ланкин, 1985).
В конце 1960-х годов было открыто семейство ферментов –
су
пероксиддисмутаз (СОД
тации О
•-
в тысячи раз (McСord and Fridovich, 1969). Весьма
2
), которые ускоряют реакцию дисму-
16
широкая распространенность СОД, многообразие ее форм, отличающихся и по структуре апофермента, и по иону металла
в активном центре (Mn, Zn или Fe) послужили веским доказательством того, что АФК образуются в живых системах регулярно. Именно с открытия СОД началась систематическая работа по изучению роли АФК в процессах жизнедеятельности.
Поэтому СОД с самого начала стали рассматривать как возникший в ходе эволюции главный инструмент защиты организма от «окислительного стресса»,
определяемого как совокупность разрушительных явлений, сопутствующих кислородному дыханию за счет неизбежного побочного образования
АФК, как представлялось и представляется по сей день многим
исследователям (Fridovich, 1999 и др.). В катализируемой СОД
реакции дисмутации продуктом является триплетный кислород,
а не возбужденный синглетный, как при спонтанной дисмутации О
ротов (k
10
•-
. СОД – чрезвычайно активный фермент: число ее обо-
2
) – одно из самых высоких для ферментов – порядка
6 с-1
cat
, а константа скорости (k
/Km) >108 М-1с
cat
-1
(Walsh, 1979),
следовательно, она должна практически немедленно устранять
образующийся О
По ряду имеющихся оценок, стационарный уровень О
•-
до ничтожно низкого стационарного уровня.
2
•-
в клет-
2
ках и тканях, несмотря на наличие многих и достаточно интенсивных источников его генерации, чрезвычайно низок, – поряд-
-10
ка 10
-11
-10
M (Niviere and Fontecave, 1995). Это как раз и спо-
собствует тому, чтобы в клетках и тканях не развивались повреждающие их структуры окислительные процессы, но в то же
время, чтобы был некий достаточный «запас» этой АФК, необходимый для генерации ЭВС.
Следующим ферментом, стоящим на пути превращений
АФК, является каталаза. Она предотвращает неконтролируемое
гомолитическое расщепление перекиси водорода и с громадной
скоростью – число оборотов более 10
7 М-1с-1
4х10
(Walsh, 1979) – превращает H2О2 в кислород и воду.
7
с-1, константа скорости
Поэтому даже в пероксисомах, где перекись водорода непрерывно продуцируется в ходе ферментативных реакций, стацио-
17
нарный уровень H2О2 не превышает 100 нМ, а в цитоплазме
он оценивается в диапазоне 10
-7 – 10-9
M (Tyler, 1975).
Еще один широко распространенный фермент, который
устраняет H
, – глютатионпероксидаза (ГПР) (Ланкин, 1985),
2О2
катализирующая реакцию окисления восстановленного глутатиона пероксидами, превращая последние в спирты (или воду
в случае H
2О2
).
Помимо ферментных защитных систем существуют неферментативные способы предотвращения чрезмерного развития
свободно-радикальных процессов в живых организмах. Прежде
всего к таким антиоксидантным системам следует отнести систему витамина Е, аскорбиновую кислоту, каротиноиды и др.
1.5. Двоякая роль АФК и свободно-радикальных реакций
в жизнедеятельности
Среди исследований в области свободно-радикальных
процессов все больше и больше появляется работ, у
щих на двойственную роль АФК, проду
ктов их взаимодействия
казываю-
с биосубстратами, свободных радикалов другой природы
в функционировании живого – с одной стороны, как факторов
повреждающих, но и с другой стороны, как необходимых регуляторов многих процессов в организме (Гамалея и Клыбин,
1996; Dalton et al., 1999; Воейков, 2001; Meier, 2001; Voeikov,
2001; Турпаев, 2002). В связи с вышесказанным обратимся сно-
ва к работам школы профессора Б.Н. Тару
сова и подчеркнем,
что в 1950-1960-х годах на кафедре биофизики биологического
факультета МГУ
активно велись исследования, посвященные
роли свободно-радикальных состояний, в том числе и АФК,
в процессах нормальной жизнедеятельности различных организмов (Журавлев, 1982).
Убедительные доказательства положительного влияния
АФК на функционирование митохондрий были получены под
ру
ководством профессора М.Н. Кондрашовой в Институте тео
-
ретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино-наОке). В работе И.Р. Саакян с соавт. (1998) показано усиление
18
индуцируемого перекисями освобождения ионов кальция из
предварительно нагруженных этими катионами митохондрий.
При продолжительном воздействии потока отрицательных аэроионов (супероксиданион радикалов) на гомогенаты, хранящиеся на льду, и последующей инкубации в средах, обработанных отрицательными аэроионами (т.е. О
•-
), в них наблюдалось
2
нарастание уровня продуктов ПОЛ при исходно низком их содержании и его снижение при исходно высоком уровне. Диапазон изменений концентраций продуктов ПОЛ в этих условиях
оказался существенно ниже, чем при его патогенной интенсификации. Обнаруженная авторами мягкая активация процессов
ПОЛ рассматривается как первичный физико-химический механизм благотворного действия отрицательных аэроионов.
Здесь еще раз у
местно отметить, что и сами АФК,
по крайней мере, в виде отрицательных аэроионов, находящиеся в воздухе, являются
полезными для жизнедеятельности факторами окружающей среды. Установлено, что отрицательно
заряженные аэроионы – это гидратированные супероксиданион
радикалы (О
•-
)(H2O)m и что свое действие они оказывают бла-
2
годаря тому, что представляют собой СР-частицы, порождающие все другие формы АФК, а не за счет того, что несут электрический заряд. Стоит повторить, что нормальный «свежий»
воздух должен содержать, по меньшей мере, 500 таких ионов
3
в см
воздуха, тогда как содержание кислорода в том же объеме
16
в 10
раз больше.
Аэроионизация воздуха отрицательно заряженными ионами сейчас используется довольно широко. Установлено, что
при увеличении содержания аэроионов в среде у многих больных с различной патологией нормализуется состояние, повышается устойчивость организма к неблагоприятным факторам
(Гольдштейн, 2002). В работе Kondrashova et al. (2000) показано, что при воздействии отрицательных аэроинов, генерируемых люстрой Чижевского, выявляются физико-химические механизмы их благотворного влияния на ассоциаты митохондрий,
а именно усиление стру
ктурной организации и интенсификация
энергетических процессов в митохондриях. Непосредственным
19
активатором является перекись водорода, образующаяся в микромолярных концентрациях из супероксиданиона.
В связи с вышесказанным возникает сложная задача выяснить, в чем различие механизмов действия АФК в малых
и больших дозах, когда наступает сбой в системах, отвечающих
за определенное сбалансированное состояние в организме,
не позволяющее развиваться зависимым от свободных радикалов повреждениям и патологиям, и др.
Следу
также отметить, что есть еще по крайней мере
ет
три системы, довольно подробно изучаемые в настоящее время,
где роль АФК, пожалуй, является главной в функционировании
этих систем. Первая система – это монооксигеназная цитохром
Р-450-зависимая система гепатоцитов, ответственная за метаболизм таких эндогенных субстратов, как, например, холестерин и стероидные гормоны (колл. монография «Гепатоцит» /
Отв. ред. Л.Д
. Лукьянова/, 1985; Goeptar et al., 1995). Другая
важная функция этой системы – это детоксикация чужеродных
для организма химических гидрофобных веществ – ксенобиотиков (Парк, 1973; Арчаков, 1975 и др.). Вторая система –
это оксидазная система нейтрофилов и других лейкоцитов крови (Babior, 1999; Владимиров и Шерстнев, 1989) и третья –
NO-синтаза эпителиальной выстилки сосу
(Beckma
n et al., 1990; Silverton et al., 1995).
дов и других тканей
Этот далеко не весь перечень примеров систем указывает
на важность оценки роли АФК в организме как минимум с двух
сторон. К настоящему времени уже накоплен значительный
экспериментальный материал, показывающий, что практически
во всех клетках и тканях животных организмов присутствуют
ферментные системы оксидазного типа, образующие АФК
(Babior, 1999; Jones et al., 2000).
Обнаружение в каждом конкретном слу
после которого
кардинально меняется роль АФК в гомеостазе
чае того порога,
организма, представляет собой важную и непростую биологическую задачу. При ее решении необходимы сравнительная
оценка свойств и механизмов действия АФК и свободных радикалов на биологические структуры и процессы, диагностика,
20
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]