Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
тестирование и корректировка состояния живых объектов при
их функциональном отклике на воздействие определенных
факторов окружающей среды на всех уровнях биологической
организации. В конечном итоге может быть выявлено влияние
СР-процессов и его последствий на экологические закономерности сосуществования живых организмов в биогеоценозе.
По большому счету, именно вышеперечисленные проявления жизнедеятельности связаны с инициирующей ролью АФК
в различных жизненно важных или патологических процессах.
Главная роль принадлежит здесь супероксиданион радикалу
как первоначальному проду
ния
молекулярного кислорода.
кту одноэлектронного восстановле-
Энергия ЭВС (Шляпинтох и др., 1966; Владимиров и Арчаков, 1972), генерация которой напрямую связана с образованием супероксиданион радикала и других продуктов восстановления молекулы кислорода, может передаваться от мест
генерации к местам реализации как с некоторой потерей в виде
излучения, так и путем безызлучательного переноса и играть
важную роль в разнообразных физиологических процессах
(Cilento and Adam
, 1995; Баскаков и Воейков, 1996). За
счет
накопления электронно-возбужденных частиц и молекул (например, карбонильных соединений) и освобождения энергии
ЭВС при их релаксации в клетке могут осу
емкие процессы
(Рид, 1960; Phillips, 1965; Журавлев, 1972;
ществляться энерго-
Campbell, 1988; Cilento and Adam, 1995; Баскаков и Воейков,
1996). Кроме того, создаваемые ансамблями возбужденных
частиц электромагнитное поле и излучения, сопровождающие
его осцилляции, могут, по-видимому, играть информационную
роль в биосистемах (Gurwitsch, 1924; Казначеев и Михайлова,
1981; Galantsev et al., 1993; Novikov et al., 1994; Кузин, 2000;
Бурлаков и др., 2000). Все эти феномены в совокупности реализуются для осуществления некоторых важных реакций в клетках, живых организмах, обеспечивая их целостность.
Итак, к настоящему времени известен довольно широкий
спектр систем, генерирующих АФК и, следовательно, ЭВС,
к которым прежде всего надо относить ферментные НАДФН-
21
и НАДН-зависимые оксидоредуктазные комплексы, распространенные в различных клеточных и тканевых системах живых организмов: в соединительной ткани, эндотелии, фагоцитирующих
клетках, гепатоцитах, клетках коры надпочечников, некоторых
видах нервной и мышечной ткани и т.д. у животных (Владимиров и Шерстнев, 1989; Meier et al., 1991; Goeptar et al., 1995;
O’Donnell and Azzi, 1996; Babior, 1999), а также у фотосинтезирующих водорослей, в зеленых листьях растений и в некоторых
других растительных тканях (Elstner and Heupel, 1974; Hiray
am
a
et al., 1996; Самуилов и др., 2001). Приведем один важный при-
мер. Увеличение потребления кислорода с превращением его
в АФК – событие, без которого невозможно оплодотворение
сперматозоидом яйцеклетки (Klebanoff et al., 1979), а, значит,
и развитие многоклеточного организма. Одно из первых событий
при оплодотворении – резкая активация НАДФН-оксидаз обоих
партнеров (De Lamirande and Gagnon, 1993).
Оксидазные комплексы непосредственно локализованы
в мембранных образованиях клеток (плазматическая мембрана,
эндоплазматический ретику
лум (ЭР
), мембраны фагосом, граны
хлоропласта и т.д.). Ответственными за генерацию АФК и в то же
время чувствительными к их воздействию в организме животных являются также фотобиологические системы, такие, как
зрительная (фоторецепторные мембраны (ФРМ) палочек и колбочек сетчатки, хрусталик), светочу
вствительные пигментные
системы кожи, в которых развиваются фотодинамические процессы (Kagan et al., 1973; Островский
и др., 1987).
Особое место занимают процессы с участием АФК, отвечающие за поддержание жизнедеятельности организмов в окружающей среде, за их адаптивные реакции, за надежность работы защитных систем организма (иммунная, система детоксикации), короче говоря, такие процессы, которые могут обеспечивать определенный гомеостаз, физиологический стату
с
и взаимоотношения организмов в биоценозах (Bingham, 1991;
Stepanova et al., 2000; Котелевцев, 2010
и др.).
Таким образом, реакции с участием АФК в живых систе-
мах могут быть основой для оценки различных изменений фи-
22
зиологического состояния организмов, в том числе и после воздействий внешних факторов физической [радиация, различные
физические поля и излучения, среди которых особый интерес
представляют слабоинтенсивные воздействия (Пресман, 1997)]
и химической природы (токсические вещества, наркотические
средства, канцерогенные агенты, отходы химических производств).
23
ГЛАВА II
СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ
В БИОСИСТЕМАХ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ
ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
2.1. Свет и роль свободно-радикальных реакций
в зрительной рецепции
Одним из важных для жизнедеятельности факторов среды
является свет. В ходе эволюции появлялись разнообразные органы и системы восприятия света – от фототаксиса у простейших,
фототропизма и фотосинтеза у растений до важного физиологического процесса у животных организмов – процесса зрительной
рецепции света. К началу наших исследований (70-е годы
XX столетия) еще не было накоплено достаточного экспериментального материала о роли свободных радикалов в процессе зрительной рецепции у животных и человека. Следовало поставить
важный вопрос: возможно ли с у
веренностью говорить о роли
фотоиндуцированного образования АФК, развития СР-реакций
в мембранных образованиях глаза? Поэтому было решено выяснить, создаются ли во время фоторецепторного акта условия образования АФК, являются
ли они причиной возникновения
СР реакций, в частности ПОЛ, в структурах сетчатки глаза различных животных, и как развитие этих реакций отражается на
функциональных особенностях зрительной системы. Тем более,
что предпосылки для реализации такой задачи су
ществуют
в самой организации зрительной системы. Рассмотрим их.
2.1.1. Условия, способствующие активации АФК
и свободно-радикальных реакций в структурах глаза
Сетчатка глаза – одна из наиболее аэрируемых тканей ор-
ганизма, в ней сосредоточена сложнейшая система фоторецеп-
24
торов – палочек и колбочек. Зрение – это фотобиологический
и физиологический акт, связанный с поглощением квантов света зрительными пигментами родопсином и йодопсином, локализованными соответственно в мембранах наружных сегментов
(НС) (дисков) палочек и колбочек (Этингоф, 1967; Боровягин
и др., 1971; Dillon, 1991 и др.). Благодаря тому, что сетчатка –
одна из самых аэрируемых тканей организмов, в ней происходит ряд событий, которые помимо передачи зрительного сигнала приводят к генерации энергии электронного возбуждения,
т.е. активации кислорода. Строение и физико-химическая организация фоторецепторов также способству
ют этим
явлениям.
Во-первых, мембраны фоторецепторов относятся к типу
метаболически активных жидких мембран, для которых характерно высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот
(ПНЖК) (в особенности докозогексаеновой, более 30%)
(Giusto et al., 2000 и др.), несу
щих существенную функциональную нагрузку. Отсутствие этих незаменимых жирных кислот
в диете приводит к крайне нежелательному снижению уровня
ПНЖК в фосфатидилэтаноламине, фосфатидилхолине и фосфатидилсерине – основных ФЛ ФРМ сетчатки, где сохранность
полиенов обеспечивается специальными механизмами их «консервации», в то время как в других тканях развиваются характерные признаки авитаминоза F (Anderson and Maude, 1972).
Во-вторых, локализация значительной части молекулы
родопсина в липидном слое мембран дисков фоторецепторов
и дополнительное погружение ее в липиды после освещения
вследствие у
тельного
меньшения величины пространственного отрица-
заряда полярной части молекулы (Blasie, 1972), а также зависимость свойств (спектральных, способность к фотолизу и регенерации) самого фоторецепторного липохромопротеидного комплекса от ассоциированных фосфолипидов (Krinsky
1958 и др.) свидетельствую
т о непосредственном участии ли-
,
пидного окружения родопсина в механизмах рецепции света.
Полиеновые липиды мембранных структур клетки выступают субстратами СР-окисления, на начальных стадиях которого
в гидрофобных остатках фосфолипидов появляются полярные
гидроперекисные группировки (Wills, 1971; Козлов и др., 1977;
25
Kayatz et al., 2002). Эти первичные молекулярные продукты об-
разуются в результате взаимодействия АФК с жирнокислотными
остатками ФЛ мембран. В случае функционирования фотоцепторов активация кислорода, как мы вначале предположили, могла
происходить при возбуждении светом родопсинового комплекса,
а процесс ПОЛ можно было бы назвать фотоиндуцированным.
Особого внимания заслуживал вопрос о регулярности и степени
«фотопереокисления» ФРМ, о его глубине. Для ответа на этот
вопрос и на ряд других мы предприняли исследование закономерностей развития кислородзависимых СР-состояний в сетчатке
и мембранах фоторецепторов. Забегая вперед, отметим, что одним из важных результатов этой работы стала возможность определения по изученным параметрам чувствительности фоторецепторов к окислительной деградации в результате активации
кислорода при акте поглощения света сетчаткой. Таким образом
была разработана тест-система, основанная на реакциях АФК
с жизненно важными рецепторными стру
системы
животных.
ктурами зрительной
Нами впервые было установлено, что родопсиновый комплекс играет непосредственную роль в СР-окислении липидов
ФРМ и сетчаток в целом (Kagan et al., 1973), был снят спектр
действия этого процесса и получены результаты, представленные на рис. 2.1.1.1.
При освещении равноквантовыми световыми потоками
(6,5х10
14
квантов на 1 см2 за 1 с) различных длин волн (частичное разложение белого света по определенным длинам волн
с помощью набора интерференционных светофильтров с максимумами пропускания при 455, 494, 508, 551 и 668 нм) максимальное количество ГП липидов накапливалось в области
508 нм, уменьшаясь до величины неосвещеного контроля как
в сторону более коротких (455 нм), так и в сторону более длинных волн (668 нм). Обращают на себя внимание два обстоятельства: во-первых, амплитуда накопления проду
в липидах из
НС выше, чем в целых сетчатках, что указывает
ктов ПОЛ
на преимущественную локализацию процесса ПОЛ в ФРМ. Вовторых, спектр действия индуцированного светом ПОЛ совпадал со спектром поглощения родопсина и кривой спектральной
26
чувствительности сетчатки глаза лягушки (преимущественно
палочковой), что говорит о вовлечении родопсинового комплекса в этот процесс. Наконец, освещение суспензии НС
в присутствии природного ингибитора СР-реакций d,l,α-токоферола (в концентрации 5х10
-5
М) не приводило к превышению
содержания ГП липидов относительно темнового контроля.
Рис. 2.1.1.1. Спектр действия фотоиндуцированного окисления
липидов сетчатки и НС палочек лягушки (по данным
спектрофотометрии): 1 – освещенные сегменты;
2 – освещенные сетчатки; 3 – темноадаптированные сегменты;
4 – темноадаптированные сетчатки.
По оси абсцисс – длины волн освещения сетчаток и НС;
по оси ординат – накопление диеновых конъюгатов:
D/C – относительная оптическая плотность при λ
С – концентрация общей фракции липидов, мг/мл
= 232 нм;
макс
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют
об индукции светом реакций СР-окисления в липидной фазе
мембран фоторецепторов сетчатки лягушки, опосредуемой зрительным пигментом родопсином.
2.1.2. Возможные механизмы активации кислорода
и свободно-радикальных состояний
в фоторецепторной системе
Вопрос о том, каким образом в сетчатке при поглощении
квантов света генерируются возбужденные состояния, приво-
27
дящие к активации кислорода и светозависимого окисления
липидов, является ли родопсин непосредственным сенсибилизатором своего ближайшего окружения или эту роль выполняют продукты его фотолиза, например ретиналь, является важным для понимания механизмов реализации энергии электронного возбуждения в фоторецепторной системе.
Остановимся на возможных механизмах активации кислорода в фоторецепторной системе. Боргу и Гради еще
в 1968 году у
родопсина при действии
далось зарегистрировать образование радикала
видимого света (Grady and Borg, 1968),
хотя в дальнейшем результаты этих экспериментов не получили подтверждения (Alekseev, 1974). В наших экспериментах
методом ЭПР не удалось обнаружить фотоиндуцированные
радикалы родопсина при действии видимого света в препаратах
НС-палочек и экстрактах родопсина при 77°K (Новиков, 1975),
хотя, как в работе (Alekseev, 1974), образование радикалов регистрировали при действии УФ-диапазона (короче 410 нм).
Образование таких фотоиндуцированных СР-центров в
зрительном пигменте может способствовать переходу кислорода в синглетное возбужденное состояние (
1
О*2) при условии,
если в процессе обесцвечивания родопсина образуются интермедиаты его фотолиза в триплетном возбужденном состоянии.
Только тогда они смогут провзаимодействовать с молекулярным кислородом, находящимся в основном триплетном состоянии, с образованием
1
О*2 [прямая реакция триплетной молекулы с синглетной с образованием продуктов в синглетном состоянии невозможна (Eyring, 1935)]. По данным литературы,
таких триплетных состояний в процессе обесцвечивания родопсина не образуется (Rosenfeld et al., 1974; Schaffer et al., 1975),
однако конечный продукт фотолиза зрительного пигмента –
ретиналь, находящийся в возбужденном триплетном состоянии
(Wald, 1968), способен активировать кислород до его синглетвозбужденного состояния (Krasnovsky and Kagan, 1979).
28
2.1.3. Ферментные и неферментные системы регуляции
образования АФК и перекисей липидов
в мембранах фоторецепторов
Принято считать, что энергия этого электронного возбуждения может реализоваться исключительно как повреждающий фактор (Krasnovsky and Kagan, 1979) за счет, например, генерации перекисных радикалов в липидах ФРМ (Anderson et al., 1985). Этот
процесс, безусловно, может развиваться в мембранных структурах
сетчатки (см. ниже), но скорость накопления продуктов ПОЛ, их
стационарные концентрации, по-видимому, не всегда обеспечивают значимую степень повреждения, так как достаточно быстро
срабатывают механизмы как регенерации родопсина после его
обесцвечивания (первые работы относятся к 60-70-м годам прошлого века), так и системы регуляции СР-процессов. К последним
прежде всего следу
ет
отнести d,l,α-токоферол (витамин Е), которо-
го, как уже довольно давно известно (Daemen, 1973), в ФРМ находится значительное количество – на 10 молекул родопсина приходится 1 молекула токоферола. Витамин Е выступает как в роли
тушителя синглетного кислорода, так и обладает антирадикальной
активностью (Guajardo et al., 1999; Terrasa et al., 2009). Уже давно
было показано наличие супероксиддисмутазной активности в целой сетчатке и НС (Hall and Hall, 1975), однако до сих пор не совсем
ясно, какими путями идет образование супероксиданион радикала
кислорода в зрительной системе.
Мы не смогли обнару
чатки
лягушки и рыбы минтая НАДФН и НАДН-зависимые
жить в мембранах НС-палочек сет-
системы генерации АФК, о чем судили по отсутствию влияния
на скорость окисления адреналина в адренохром в присутствии
этих восстановительных эквивалентов (рис. 2.1.3.1, а, б).
Не было также обнаружено накопления продуктов ПОЛ
в НС-палочек сетчатки этих животных при использовании различных способов обработки образцов препаратов НС. Так, например, отсутствие НАДН- и НАДФН-зависимого процесса образования перекисей липидов в НС не является следствием недоступности НАДН- или НАДФН-зависимых генераторов проду
ПОЛ (следили
за образованием МДА через 30 мин после воздей-
ктов
29
ствия) для восстановленных пиридиннуклеотидов, поскольку
добавление последних при обработке суспензии НС-ультразвуком
(УЗДН-2, 22 кГц, 4 раза в течение 30 с) также не приводило
к активации ПОЛ. Следует отметить, что отсутствие влияния
восстановительных эквивалентов (НАДН или НАДФН) на содержание перекисей характерно для НС как с полностью обесцвеченным, так и с необесцвеченным родопсином.
а
б
в
Рис. 2.1.3.1. Скорости окисления адреналина в адренохром
в присутствии мембран фоторецепторов сетчатки минтая, Fe
восстановленных пиридиннуклеотидов и феназинметасульфата (Ф):
а – в присутствии мембран НС сетчатки; б – изменения во времени
в спектре поглощения системы НС+ Fe
в – в присутствии мембран ВС палочек:
– Fe2+
(10-5 М), 2, 7 – Fe2+ и НАДН (5×10-4 М),
3 – Fe
1, 5
2+
, НАДН и Ф (10-6 М), 4, 6 – Fe2+ и НАДФН (5×10-4 М)
+2
+адреналин+НАДН+Ф;
+2
,
Это, по-видимому, явилось приспособительным механизмом
для функционирования фоторецепторной системы, так как позво-
30
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]