Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
ределять и нарушения в ионном транспорте эритроцитов этих
рыб. Однако проведенные в аквариумах эксперименты позволяют предположить, что нарушения в ионном транспорте связаны,
скорее всего, именно с действием радиационного облучения.
2.2.2. Монооксигеназные активности плаценты
жителей Алтайского края, подвергавшихся
действию испытаний ядерного оружия
В настоящее время можно считать точно доказанным, что
неблагополучная медицинская обстановка в ряде районов Алтайского края была связана с воздействием на население наземных испытаний ядерного ору
с 1949
по 1965 год (Шойхет и др., 1993). Это явилось основой
жия, происходивших в период
для проведения комплексных исследований изменений мембранных структур клеток крови, а также мембран ЭР плаценты
жительниц некоторых районов Алтайского края.
При этом рассматривалась возможность модификации
мембранных стру
р
не только у людей, непосредственно под-
кту
вергшихся действию ядерных испытаний, но и у их потомков.
Другим важным моментом мы считали возможность совместного действия на генетический аппарат мутагенных ксенобиотиков и радионуклидов. Ввиду того, что большинство мутагенных и канцерогенных соединений обладают гидрофобными
свойствами, они способны накапливаться в биологических
мембранах, изменять их физико-химические свойства и активность мембранно-связанных ферментов.
Как отмечалось выше, мембраны форменных элементов
крови являются одной из основных мишеней, поражающихся
малыми дозами ионизирующей радиации. Активация молекулярного кислорода, образование его активных форм и непосредственное воздействие на мембранные липиды, сопровождающееся липопереокислением, приводит как к нарушению
пассивной проницаемости мембранных стру
, так и к непо-
ктур
средственной модификации мембранно-связанных ферментов,
осуществляющих транспорт ионов и регулирующих ионный
41
гомеостаз в эритроците – одну из основных функций, обеспечивающую нормальную работу клетки. Существует возможность наследования ряда мембранных дефектов эритроцитов,
определяющих не только наследственные заболевания (например, серповидноклеточная анемия, талассемия), но и функциональные нарушения, предрасположенность к ним (например,
гипертония). Нарушение мембранных структур форменных
элементов крови возможно и под воздействием химических
веществ, попадающих в организм животных и человека.
Кроме того, изучали монооксигеназные и конъюгационные активности ферментов плаценты рожениц некоторых районов Алтайского края. Было проведено изучение характера как
активностей монооксигеназ (содержание изоформ цитохрома
Р-450 в плаценте и их специфические активности), так и активности ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков,
осу
ществляющих
кислотой в плацентах рожениц ряда районов Алтайского
вой
их конъюгацию с глютатионом и глюку
роно-
края. Параллельно осуществлялся контроль за степенью липопереокисления в крови новорожденных и рожениц, контроль
на мутагенность и канцерогенность содержащихся в плаценте
соединений с помощью теста Эймса (Ames et al., 1973). Этот
тест позволил также определять характер метаболической активации в мембранных системах цитохрома Р-450.
Здесь приводятся данные, непосредственно касающиеся
вовлечения систем детоксикации, связанные с активацией кислорода в НАДФН и цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной системе плаценты. Для тестирования использовали су
страты ряда изоформ цитохрома Р-450 7-этоксикумарин (7-
б-
ЭК)
и 7-этоксирезоруфин (7-ЭР).
Концентрации общего пула цитохрома Р-450 в исследованных образцах плацент (табл. 2.2.2.1) не превышали 0,05 нмоль/мг
микросомного белка, что соответствует норме (Pelkonen et al.,
1980). Не было отмечено су
цитохрома Р-450 в микросомах, полученных из плаценты
щественных различий в содержании
в том
случае, если матери не курили в период беременности.
42
Таким образом, было отмечено только в одном случае
превышение в содержании цитохрома Р-450 у женщины, которая курила во время беременности. У нее же было отмечено
высокое значение этоксикумарин-О-деэтилазной (ЭКОД) активности в микросомной фракции плаценты.
Содержание цитохрома Р-450 в микросомах плаценты женщин,
проживающих в районах Алтайского края,
подверженных влиянию последствий ядерных испытаний
Таблица 2.2.2.1
Номер клинического
документа
35
36
45
46
47
48
58
К
68
69
71
72
Примечания: (х +σn ) 159+48,7
К
Мать курила и поэтому значение содержания цитохрома Р-450 не
выпало из статистического анализа
n = 10.
Год рождения
матерей
1972
1972
1967
1973
1969
1974
1972
1964
1971
1962
1971
(-)
.
Содержание
цитохрома Р-450,
пмоль/мг белка
129
132
132
114
129
224
272
(-)
225
183
135
143
Плацентарные ЭКОД-активности практически во всех образцах были низкими. В некоторых образцах этот тип активности вовсе не обнаруживался. Низкая ЭКОД-активность коррелировала с таковой ЭРОД.
Все обследованные роженицы и новорожденные были
разбиты на четыре группы. К первой группе относили тех из
них, кто проживал на территориях Алтайского края, наиболее
пострадавших от испытаний ядерного ору
жия, и где общая эф-
43
фективная доза облучения составляла более 100 сЗв. В отдельную, вторую группу были объединены матери, проживающие
в Тальменском районе. Этот район, хотя и несущественно пострадал от ядерных испытаний, выделяется среди других регионов Алтайского края неблагоприятной медицинской обстановкой и рядом других медико-гигиенических факторов.
К третьей группе отнесены роженицы, которые проживали
на территориях, частично подвергавшихся воздействию ядерных испытаний (расчетная доза менее 20 сЗв), и четвертая
группа была составлена из жительниц населенных пунктов,
входящих в районы Алтайского края, наименее подвергшихся
воздействию испытаний ядерного ору
жия.
Таким образом, в первую группу вошли роженицы, матери которых и они сами проживали в г. Ру
с 1949
Во
по 1965 год и получили общую дозу более 100 сЗв.
вторую группу выделены, как отмечалось выше, роженицы
бцовске в период
из Тальменского района. Третья группа – роженицы из районов,
в которых доза общего облучения была около 10 сЗв.
Были обследованы жители различных районов Алтайского края и, естественно, подвергающиеся в разной степени влиянию неблагоприятных факторов окру
жающей среды. При
обсуждении результатов в первую очередь были выделены два
фактора: воздействие ионизирующей радиации в прошлом
и возможность возрастающего токсического действия ксенобиотиков в настоящее время.
Анализировали характер липопереокисления в крови и плаценте новорожденных и рожениц, исследовали активности изоформ цитохрома Р-450, а также активности ферментов второй
фазы детоксикации ксенобиотиков, осу
ществляющих
их конъ-
югацию с глютатионом и глюкуроновой кислотой.
Мы исследовали женщин из различных районов Алтайского края, которые родились значительно позже 1962 года (последний срок испытаний ядерного оружия) и непосредственно
не подвергались радиоактивному заражению. Те нарушения,
которые можно было наблюдать в монооксигеназных
и конъюгационных реакциях в плацентах матерей и в состоя-
44
нии здоровья их новорожденных детей (гемолитическая желтуха и пр.), возникали, скорее всего, в результате аномалий генетического аппарата представителей более старшего поколения,
проживавших непосредственно на территориях, загрязнявшихся радионуклидами в момент или вскоре после ядерных испытаний. До настоящего времени это положение остается гипотетическим и требует экспериментальной проверки. К сожалению, аварии, просходящие на атомных электростанциях (например, в Японии), по-видимому, позволят собрать необходимый для доказательства этой гипотезы экспериментальный материал!
160
140
120
100
80
60
40
Активность (% от контроля)
20
0
1 контроль 23
120
100
80
60
40
20
Активность (% от контроля)
0
1 контроль 23
2 ГТ цитозольная
1 УДФ-ГТ
120
100
80
60
40
20
Активность (% от контроля)
0
1 контроль 23
3 ГТ микросомальная
Рис. 2.2.2.1. Активности глютатион S-трансферазы
и УДФ глюкуронозил трансферазы в плаценте матерей
и новорожденных из разных районов Алтайского края.
Стандартное отклонение – направленная вверх серая штриховка
столбиков: 1 – контрольная группа; 2 – районы, умеренно
подвергавшиеся влиянию последствий ядерных испытаний;
3 – районы, сильно подвергавшиеся влиянию последствий
ядерных испытаний
45
В связи с вышеизложенным небезынтересно указать на
появление в последнее время работ о протектирующем действии малых доз радиации на монооксигеназную систему печени
животных. В одной из таких работ (Yukawa et al., 1999) показано, что после воздействия на животных малых доз радиации
происходит увеличение антирадикальной способности цитозоля (за счет индукции ГР-системы), что повышает устойчивость
цитохром Р-450-зависимой системы к повреждению радикалами, возникающими при облучении большими дозами.
Таким образом, примененные нами методы измерения
ферментов детоксикации в микросомах плаценты и регистрации соответствующих монооксигеназных активностей могут
являться частью комплексного анализа эпидемиологического
состояния здоровья населения в районах, подвергшихся радиоактивному загрязнению. Эти тесты, основанные на измерении
скоростей реакции гидроксилирования гидрофобных су
тов с помощью оксидоредуктазной цитохром Р-450-
бстра-
зависимой
системы, могут быть рекомендованы к дальнейшему применению в подобных мероприятиях для диагностики скрытых мембранных патологий.
Параллельно в плаценте рожениц с помошью теста Эймса
исследовали содержание мутагенных и канцерогенных соединений.
Тест позволил не только зарегистрировать мутагенные
соединения, но и определить характер их метаболической активации в системе цитохрома Р-450.
46
ГЛАВА III
ОЦЕНКА СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ
НА МИКРОСОМНОЙ МОДЕЛИ
ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ
3.1. Анализ состояния проблемы
Долгосрочная адаптация организма к меняющимся условиям в результате действия физических или химических факторов окружающей среды сопровождается возникновением системного структурного следа, устранение которого после прекращения действия побудительного стимула открывает дорогу
для создания новых структурных следов и, следовательно, получения новых адаптационных возможностей (Меерсон, 1981).
Отсюда очевидна важность механизмов, осу
ществляющих
стирание структурного следа, т.е. разборку синтезированых de novo
структур, участвующих в адаптации. Примером возникновения
и устранения структурного следа являются индукция системы
оксигеназ со смешанной функцией, локализованной в мембранах ЭР печени и некоторых других тканей, при попадании
в организм чу
жеродных экзогенных гидрофобных су
бстратов
(ксенобиотиков), и последующая разборка индуцированных
структур (Арчаков, 1975; Ляхович и Цырлов, 1981).
Система монооксигеназ в эндоплазматическом ретикулуме
печени (и некоторых других тканей) осуществляет пластическую
(метаболизм стероидов, жирных кислот и т.д.) и детоксицирующую (гидроксилирование чужеродных соединений) функции,
превращая гидрофобные субстраты в более полярные соединения (Арчаков, 1975). В реакциях метаболизма су
бстратов уч
аствуют различные формы цитохрома Р-450 (Kaminsky et al., 1980;
Lisitsa, 2001 и др.).
В целом монооксигеназная система представляет собой
мембранный полиферментный комплекс, существенную роль
47
в функционировании которого играют фосфолипиды. Они являются динамичным матриксом для белковых компонентов
этой электронтранспортной цепи: НАДФН-цитохром Р-450
зависимая оксидаза, НАДН-цитохром b
цитохром b
и терминальная оксидаза моноокигеназной систе-
5
-зависимая оксидаза,
5
мы – цитохром Р-450. В клетке всегда присутствует некое соотношение форм цитохрома Р-450, каждая из которых обладает
собственной субстратной специфичностью. Изоформы цитохрома Р-450 являются ключевым звеном монооксигеназной
системы, обладающие специфичностью к метаболизму ряда
гормонов и большому разнообразию гидрофобных ксенобиотиков. Определенные классы химических соединений способны
вызывать индукцию множественных форм цитохрома Р-450
и монооксигеназных активностей, катализиру
емых этими изо-
формами (Boobis et al., 1977; Lisitsa, 2001). В результате индукции
ксенобиотиками это соотношение форм может изменяться,
а индукция в свою очередь приводит к изменению соотношения
фосфолипидов в мембранах ретикулума и зависящей от липидного окружения ферментативной активности (Ляхович и Цырлов, 1978; Дятловицкая и др., 1984; Dham
Система монооксигеназ также активиру
i et al., 1985).
ется в случае необходимости синтеза или распада стероидных соединений,
окисления жирных кислот, лейкотриенов, простагландинов
и т.д.; она собирается в активный комплекс, и происходят реакции гидроксилирования, смыслом которых является внедрение
в окисляемый субстрат одного атома кислорода, а второй его
атом восстанавливается до воды (Арчаков, 1975; Метелица,
1982 и др.). Этот процесс не может происходить без генерации
АФК, благодаря которым и с помощью соответствующих ферментных компонентов и осу
ществляются, например, акты
детоксикации очень широкого круга чужеродных химических
соединений (Парк, 1973).
С позиций современной ксенобиохимии существует единый универсальный двухстадийный механизм биотрансформации ксенобиотиков. При этом в первой фазе протекает реакция
функционализации с у
частием НАДФН-зависимой
цитохром
48
Р-450-содержащей монооксигеназной системы ЭР, в первую очередь клеток печени (гепатоцитов), но также и других клеток
и тканей. Во второй же фазе происходят процессы конъюгации
ксенобиотиков или их метаболитов с крупномолекулярными
эндогенными субстратами (глюкуроновой кислотой, глютатионом). В итоге этих превращений ксенобиотики и их метаболиты
обезвреживаются и подготавливаются к безопасному выведению
из организма (эволюционно сложившаяся ситу
ация).
Однако в современной экологической обстановке имеется
и «слабое звено» в монооксигеназной защитной системе: большинство синтетических ксенобиотиков (пестициды, полихлорированные бифенилы (ПХБ), ряд лекарственных средств) в реак-
функционализации способны трансформироваться в продук-
ции
ты и соединения более опасные, чем исходные. Такое явление
получило название метаболической активации. Результаты многих исследований, проводимых нами, доказали, что ПОЛ является
тем самым механизмом, который регу
готовность системы монооксигеназ
лирует функциональную
(Каган и др., 1974; Велиханова и др., 1981 и др.). ПОЛ подготавливает к новому циклу гидроксилирования ксенобиотиков за счет способности эффективного
процесса разборки излишков мембранных компонентов и отработавших индуцированных форм цитохрома Р-450. Другим эффективным регу
мальных оксигеназ может быть фосфолипаза А
лятором гидроксилирующей способности микросо
. Она является од-
2
-
ним из важных мембранных модификаторов, приводящих к накоплению в мембранах продуктов гидролиза – свободных жирных
кислот (СЖК) и лизофосфолипидов (ЛФ). Их количество в физиологических условиях в мембранах ретикулума гепатоцитов крыс
не превышает 6% (Bjornstad, 1966). С другой стороны, оказалось,
что некоторые продукты гидроксилирования фенольной природы
способны регулировать скорость деградации цитохрома Р-450 как
in vivo, так и in vitro (Новиков и др., 1984; Каган и др.
, 1984).
Фонд
конститутивного цитохрома Р-450 по сравнению с индуцированным Р-450 более устойчив к действию ПОЛ in vivo и in vitro. При
определенной сочетанности этих проявлений, в конечном счете
определяющих, каковым будет результат реализации реакций
49
АФК в монооксигеназной системе и в организме в целом, могут
быть предложены системы тестирования, например, различных
загрязняющих факторов окружающей среды, лекарственных
средств и т.д.
Основные исследования на эту тему были проведены на
модели микросом печени крыс и рыб. На основе результатов
этих экспериментов были предложены тест-системы, позволяющие оценивать, каким образом меняется направление развития зависимых от АФК реакций в монооксигеназной системе.
Учитывались разные у
ровни загрязненности окру
жающей среды, различные условия индукции изоформ цитохрома Р-450
и гидроксилирования ими субстратов. Изучали, как влияет на
функциональную активность монооксигеназной системы активация фосфолипаз типа А
, продуктов метаболизма некоторых
2
лекарственных форм.
3.2. Механизмы инициирования АФК
и ферментативного НАДФН-зависимого ПОЛ
в микросомах печени крыс
Одной из самых распространенных моделей исследования
функционирования монооксигеназных систем детоксикации
ксенобиотиков являются микросомные фракции печени крыс.
Важной стороной такого исследования стало обнаружение мест
генерации и определение роли АФК в процессах гидроксилирования су
АФК системе, в микросомах печени
бстратов и ПОЛ. Как в любой генерирующей
удается обнаруживать различные АФК. Однако не совсем просто определить приоритетную роль какой-то из них в осуществлении акта гидроксилирования или инициации реакции свободно-радикального окисления мембранных фосфолипидов.
В результате косвенного характера большинства методов об-
наружения АФК су
ществовали различия в трактовке получающихся результатов относительно роли супероксидных и гидроксильных
радикалов в биологических системах
(McCay et al., 1976; Lai and
Piette, 1977; Saprin and Piette, 1977; Tien et al., 1981 и др.). В конце
50
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]