Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Свободно-радикальные процессы в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды. Монография
.pdf
1970 – начале 1980-х годов остро стоял вопрос об идентифика-
ции агентов – производных восстановленного молекулярного
кислорода, инициирующих ПОЛ и гидроксилирование гидрофобных субстратов. Однако уже появлялись достаточно обнадеживающие данные, говорящие в пользу гидроксильного радикала как инициатора свободно-радикального окисления липидных
компонентов мембранных образований клеток (Lai and Piette,
1977; Saprin and Piette, 1977).
Во время выполнения этой части работы
1
с НАДФН-
зависимыми реакциями ПОЛ в мембранах ЭР не было единой
точки зрения ни относительно механизмов элементарных стадий
этого процесса, ни относительно его локализации в НАДФНзависимой цепи переноса электронов. Для выяснения этих вопросов было проведено исследование по сопоставлению генерации АФК и индукции ПОЛ в мембранах микросом печени крыс
с различным содержанием НАДФН-цитохром Р-450 реду
и цитохрома Р-450. Для регистрации
радикалов использовали спиновую ловушку
бутилнитрон (II)
(ФБН) и промежуточный акцептор гидроксиль-
образования гидроксильных
С-фенил-N-
ктазы
трет
-
ных радикалов – этанол, эффективно взаимодействующий с ними и образующий устойчивые спиновые аддукты гидроксиэтильных радикалов с ФБН с соответствующими параметрами их
спектра ЭПР (Cohen and Coberbaum, 1980).
Одновременно в микросомах происходило накопление
МДА, скорость образования которого снижалась при добавлении в инкубационную среду ФБН. Этот эффект развивался
за счет конкуренции за радикалы, у
частву
ющие в инициации
НАДФН-зависимого ПОЛ, со стороны спиновой ловушки. Обнаружено также, что тепловая денатурация микросомных мембран резко снижала скорость образования спиновых аддуктов.
В отсутствие микросом скорость образования спиновых аддуктов гидроксиэтильных радикалов мала, но отлична от нуля, что
можно объяснить участием ионов экзогенного железа в реакци-
1
Работа выполнялась совместно с сотрудниками кафедры Медицинской
биофизики ГМУ им. Н.И.Пирогова под руководством академика РАМН
Ю.А. Владимирова (в настоящее время зав.каф. профессор А.Н.Осипов).
51
ях восстановления кислорода и образования соответствующих
активных радикалов и их аддуктов в водной системе, содержащей НАДФН, (Fe
2+
+ ЭДТА ), ФБН, фосфатный буфер.
Добавление СОД в изучаемую систему весьма незначительно снижало амплитуду сигнала спиновых аддуктов, а добавление каталазы резко тормозило их образование (рис. 3.2.1). При
совместном действии СОД и каталазы сигнал спиновых аддуктов гидроксиэтильных радикалов и ФБН практически не превышал фоновый. Действие этих антиокислительных ферментов
в отдельности и в их сочетании аналогично действию на
НАДФН-зависимое накопление МДА (табл. 3.2.1).
Рис. 3.2.1.Спектр ЭПР спиновых аддуктов гидроксиэтильных
радикалов, наблюдаемый в системе, содержащей микросомы (2,5 мг/мл),
НАДФН (5•10
в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4 при 37°С (а) и изменение
концентрации спиновых аддуктов гидроксиэтильных радикалов
2 – влияние СОД (10 ед./20 мкл); 3 – влияние каталазы (30 ед/200 мкл);
4 – совместное действие СОД и каталазы; 5 – в отсутствие микросом;
-4
М), (Fe2+ + ЭДТА ) (10-4 М), ФБН (2•10-2 М)
в различных условиях (б): 1 – контроль,
6 – при тепловой денатурации микросом
52
Содержание продуктов НАДФН-зависимого ПОЛ
в микросомах при действии СОД и каталазы
Скорость
Условия инкубации микросом
1. Микросомы (2,5 мг/мл),
0,5 мМ НАДФН, 0,1 мМ Fe
в 5 мМ фосфатном буфере
2. То же, что и 1,
при добавлении СОД (10 ед./мл)
3. То же, что и 1,
при добавлении каталазы (30 ед./мл)
4. То же, что и 1,
при совместном действии СОД
и каталазы
2+
+ ЭДТА
НАДФН-зависимого ПОЛ
(МДА, нмоль/мг белка в 1 мин)
1,72+0,13
0,10
0,94+
0,09
0,34+
0,16
2,22+
В совокупности эти результаты укладываются в следующую схему инициирования процесса:
Таблица 3.2.1
О
2
⎯> О
•-
⎯> Н2О2 ⎯>ОН• LН
2
Н
О L•⎯>LО
2
•
⎯>LOOH.
2
Действительно, поскольку СОД не предотвращает образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов, она
не может быть эффективным ингибитором ни НАДФНзависимого образования спиновых аддуктов, ни НАДФНзависимого ПОЛ. Слабый эффект СОД, вероятно, обусловлен
торможением регенерации ионов железа в отсутствие О
Fe
3+
+ О
•-
⎯>Fe2+ + О2.
2
•-
.
2
Ингибирующий эффект каталазы как на НАДФНзависимое образование гидроксильных радикалов, так и на
НАДФН-зависимое ПОЛ обусловлен подавлением генерации
гидроксильных радикалов вследствие исчезновения из системы
53
перекиси водорода. Наконец, практически полное ингибирование генерации аддуктов и продуктов ПОЛ в присутствии каталазы и СОД, очевидно, вызвано как устранением Н
ника ОН-радикалов, так и О
•-
, участвующего в регенерации
2
– источ-
2О2
ионов железа (Cohen and Coderbaum, 1980). Кроме того, сравнение реакционной способности супероксидных и гидроксильных
радикалов относительно жирных кислот говорит в пользу участия гидроксильных радикалов в реакциях окисления жирных
кислот. Так, константа скорости реакции гидроксильного радикала с ненасыщенной жирной кислотой составляет 10
тогда как для О
•-
аналогичная константа на 4-5 порядков ниже.
2
7
-109 М-1с-1,
Более того, в результате взаимодействия ОН-радикала с ненасыщенной жирной кислотой происходит либо отрыв электрона
от двойной связи жирной кислоты, что приводит к образованию
пентадиенильного (аллильного) радикала, либо присоединение
гидроксильного радикала по двойной связи жирной кислоты,
в результате чего образуются алкильные радикалы. Образование ОН
•
в системе микросомного НАДФН-зависимого ПОЛ
рассматривалось также в работах Lai and Piette (1977) и Saprin
and Piette (1977), им уделялась основная роль в инициировании
этого процесса. Однако в других работах (Tien et al., 1981; Метелица, 1982) предполагается, что инициаторами ПОЛ могут
быть феррил- или перферрил-ионы, образующиеся в результате
взаимодействия ионов двухвалентного железа с продуктами
восстановления молекулы кислорода и обладающие сильными
окислительными свойствами. Но скорее всего и в этом слу
инициирующим ПОЛ началом являются
гидроксильные ради-
чае
калы, так как известно, что эти комплексы распадаются с образованием OH
•
. Следовательно, доминирующим путем индукции
НАДФН-зависимого ПОЛ в микросомах печени представляется
механизм, отраженный на схеме, ключевым звеном которого
являются OH-радикалы.
Важным моментом в понимании работы этого механизма
должно быть определение участка микросомной НАДФНзависимой электронтранспортной цепи, на котором происходит
образование АФК, приводящих к инициированию ПОЛ. С этой
целью было изучено образование радикалов и измерена ско-
54
рость ПОЛ во фракциях микросомальных мембран с различным
содержанием цитохрома Р-450 и НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы. Обнаружено, что в присутствии ионов Fe
2+
(10-4 M)
во фракции с повышенной концентрацией НАДФН-цитохром
Р-450 редуктазы (180% по сравнению с контролем) и полностью лишенной цитохрома Р-450 образование спиновых аддуктов гидроксиэтильных радикалов происходит в 2,3 раза эффективнее, чем в нативных микросомах (табл. 3.2.2).
Таблица 3.2.2
Концентрация спиновых аддуктов гидроксиэтильных радикалов
в препаратах микросом с различными активностями
НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы
Препараты микросом
Нативные микросомы (100% активности НАДФН-цитохром
Р-450 редуктазы)
Фракция микросом с повышенным
содержанием НАДФН-цитохром
Р-450 редуктазы (180% активности)
Фракция микросом с пониженным
содержанием НАДФН-цитохром
Р-450 редуктазы (15% активности)
Концентрация спиновых
аддуктов, отн.ед.
0,15
1,00+
0,19
2,30+
0,10
0,26+
С другой стороны, во фракциях микросомных мембран,
практически лишенных активности НАДФН-цитохром Р-450
редуктазы (15-20% по сравнению с контролем), наличие аддуктов гидроксиэтильных радикалов почти полностью отсутствует
(см. табл. 3.2.2).
Эти результаты позволяют заключить, что участком, ответственным за генерацию АФК, является главным образом
НАДФН-цитохром Р-450 редуктаза. В соответствии с этим скорость НАДФН-зависимого ПОЛ, регистрируемого по накоплению МДА, в микросомах с разным содержанием НАДФН-
55
цитохром Р-450 редуктазы должна линейно зависеть от редуктазной активности (рис. 3.2.2).
Рис. 3.2.2. Зависимость скорости накопления продуктов
НАДФН-зависимого ПОЛ микросом от активности
НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы
Как видно из рис. 3.2.2, зависимость скорости ПОЛ от активности НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы действительно
оказывается линейной, причем прямая проходит почти через
начало координат. Иными словами, в отсутствие редуктазной
активности НАДФН-зависимое ПОЛ практически не происходит, а во фракциях с максимальной удельной активностью редуктазы наблюдается наивысшая скорость НАДФН-зависимого
ПОЛ. Коэффициент корреляции этих параметров равен 0,926.
Результаты наших экспериментов позволяют сделать
вывод о том, что генерация АФК в мембранах ЭР печени осуществляется главным образом на начальном компоненте
НАДФН-зависимой электронтранспортной цепи – НАДФНцитохром Р-450 редуктазе. В присутствии экзогенного железа
инициирование НАДФН-зависимого ПОЛ происходит на этом
же участке. Недавно эти положения были подтверждены
(
Reed et al., 2011)
.
56
Учитывая потребности биотестирования, приведенные
здесь результаты могут быть полезны и с той точки зрения, что
при испытании, например, токсичности каких-либо веществ
(загрязнителей, медикаментозных средств и т.д.) угнетение
скорости генерации АФК (определять эту скорость можно различными способами, не только с использованием спиновых
ловушек) в микросомной системе может быть в первую очередь
обу
словлено ингибирующим действием на НАДФН-
цитохром
Р-450 редуктазу. Проводя параллельно оценку степени
НАДФН-зависимой пероксидации микросомных липидов,
можно устанавливать, насколько изменилась активность фермента под воздействием токсиканта (согласно рис. 3.2.1).
Безусловно, используя микросомную систему печени как
источник АФК для анализа действия факторов окружающей
среды, необходимо всегда помнить, что эта система в организме осу
ществляет
функцию детоксикации ксенобиотиков, эффективность которой будет зависеть как от способности системы генерировать оптимальные количества АФК, так и от активности терминальной оксигеназы цитохрома Р-450, а вернее,
его множественных форм, ответственных за гидроксилирование
гидрофобных субстратов разной природы. Вопрос об устойчивости цитохрома Р-450 к различным воздействиям, в том числе
к АФК, поэтому является важным. В следу
ющих разделах
мы
уделим внимание некоторым механизмам, вовлеченным в регуляцию устойчивости цитохрома Р-450.
3.3. Взаимосвязь процессов ПОЛ и протеолиза
в деградации цитохром Р-450-зависимой системы
детоксикации ксенобиотиков в микросомах печени крыс
Из достаточно большой серии исследований, проведенных
на изолированных полиферментных системах монооксигеназ
микросомной фракции печени, следу
, что в механизмах дегра-
ет
дации цитохрома Р-450 ПОЛ, скорее всего, служит ускоряющим
фактором. Известно, что само ПОЛ в микросомах способно лишь
вызывать конверсию цитохрома Р-450 в неактивную форму ци-
57
тохром Р-420 (Каган и др., 1974; Schafer and Hultquest, 1980).
Вместе с тем при разборке цитохрома Р-450 in vivo, как правило,
не удается обнаруживать ни цитохром Р-420, ни другие продукты его катаболизма (Wills, 1971). Это означает, что наряду с процессами ПОЛ в условиях in vivo в деградации цитохрома Р-450
участвуют и другие механизмы, например, протеолитическое
разрушение цитохрома Р-450. Необходимо, однако, отметить,
что цитохром Р-450 – это обобщенное название многочисленного
семейства его изоформ, большинство из которых являются гидрофобными белками, трудно доступными для протеолитического
воздействия и обладающими различной чувствительностью
к протеолизу. Так, показано, что значительная часть пула цитохрома Р-450 в нативной микросомной мембране или гидролизуется протеазами с очень низкой скоростью, или вообще оказывается недоступной для протеолиза (Девиченский и др., 1979).
Нами было специально исследовано влияние ПОЛ на реакции протеолиза цитохрома в микросомных мембранах при
действии трипсина. На рис. 3.3.1 представлены кривые, отражающие эффекты ПОЛ in vitro на протеолитическу
ю деградацию цитохрома Р-450 в нативной микросомной фракции печени
крыс и в мембранах, предварительно подвергшихся действию
продуктов
ПОЛ.
Видно, что процесс ПОЛ и реакции протеолиза цитохрома Р-450 могут выступать в качестве двух взаимоусиливающих
процессов, обеспечивающих в совокупности, исключительно
высокую активность разборки фермента. Так, было обнаружено, что процесс трипсинзависимой деградации двухфазен:
в течение первых 1-3 мин происходит быстрое разрушение цитохрома Р-450 [V=0,03 нмоль•мг
-1
(белка) •мин-1], после чего
скорость деградации уменьшается практически до нуля при
действии трипсина в концентрации 10
-5
2•10
М трипсина скорость деградации цитохрома Р-450 равна
соответственно 0,08 и 0,0036 нмоль•мг
-6
М. При действии
-1
(белка)•мин-1. При вы-
бранных условиях протеолиза около 81% общего пула цитохрома Р-450 оказывается практически недоступным для трип-
58
сина в концентрации 10-6 М и 60% – при концентрации трипсина 2•10
-5
М, даже после 10 мин протеолиза.
а
Рис. 3.3.1. Деградация общего пула цитохрома Р-450
микросом печени крыс при протеолизе трипсином
в концентрации 10
1-3 – предварительная индукция НАДФН-зависимого ПОЛ,
накопление МДА (на 1 мг белка) 2,8 нмоля (1), 4,1 нмоля (2),
10 нмолей (3); 4, 5 – без индукции ПОЛ;
6 – индукция ПОЛ в отсутствие трипсина
-6
М (а) и 2•10-5 М (б):
б
При комбинированном действии ПОЛ и трипсина отмечены два эффекта: ускорение быстрой реакции деградации пула
цитохрома Р-450 и увеличение доступности цитохрома Р-450
для протеазы. На рис. 3.3.1 видно, что количество цитохрома
Р-450, разрушенного в результате последовательного действия
продуктов ПОЛ (по индикации накопленного количества МДА)
и трипсина, превышает результирующую этих факторов в отдельности, т.е. неаддитивно. Эти эффекты усиливаются по мере
накопления проду
ктов ПОЛ и увеличения концентрации
про-
теазы.
59
Необходимо отметить, что эффективность деградации цитохрома Р-450 в результате ПОЛ зависит от способа индукции
СР-процессов и снижается в ряду НАДФН-НАДН-аскорбатзависимое
ПОЛ.
Таблица 3.3.1
Протеолитическая деградация цитохрома Р-450
при накоплении 1 нмоля МДА в микросомах печени крыс
Скорость деградации цитохрома Р-450,
Система индукции
ПОЛ + трипсин трипсин + ПОЛ
НАДФН + Fe+2
НАДН + Fe
Аскорбат + Fe
Примечание: концентрация НАДФН, НАДН и аскорбата – 5•10-4 М,
2+
Fe
– 10-5 М, трипсина – 2•10-5 М; время измерения – первые 5 мин ин-
кубации.
+2
+2
нмоль•мг
0,158+
0,152+
0,076+
0,034
0,023
0,020
-1
(белка)•мин-1
0,183+
0,171+
0,101+
0,037
0,027
0,022
Представленные в табл. 3.3.1 данные свидетельствуют об
изменении скорости протеолиза и доступности для протеаз цитохрома Р-450 в нативных мембранах микросом печени.
В аналогичных опытах с микросомной фракцией из печени
крыс после введения им фенобарбитала (ФБ) или метилхолантрена (МХ) (табл. 3.3.2) было установлено, что НАДФНзависимое ПОЛ также ускоряет разборку и увеличивает доступность цитохрома Р-450 для протеаз.
Эффективность действия проду
выше, чем в слу
чае неиндуцированных микросом. Практически
ктов ПОЛ оказывается
полная разборка цитохрома Р-450 происходит уже при накоплении в мембранах 3,1 нмоля МДА на 1 мг белка (для неиндуцированных микросом – 10 нмолей МДА на 1 мг белка).
Итак, в микросомных мембранах процессы ПОЛ могут
выступать в качестве фактора, резко повышающего эффективность протеолитичекой деградации Р-450. Су
щественно, что
справедливо и обратное утверждение: в результате предварительного, незначительного протеолиза (2
мин) резко увеличи-
60
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]