Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Санитарная микробиология. Учебное пособие
.pdf
При окрашивании фильтры накладывают нижней стороной на кружок фильтровальной бумаги, смоченной эритрозином, и выдерживают
2–18 часов. Окраску проводят в чашках Петри с закрытыми крышками.
Отмывают краску путем перекладывания фильтра на фильтровальной
бумаге, смоченной дистиллированной водой. Процедуру повторяют до
тех пор, пока фильтр не перестает окрашивать фильтровальную бумагу. После отмывания
фильтр высушивают, помещают на предметное
стекло с каплей иммерсионного масла, сверху наносят другую каплю,
масла и накрывают тонким покровным стеклом.
Микроскопию осуществляют с иммерсионным объективом
(×90) при окуляре с сетчатым микрометром (8,0×8,0 мм)*. Подсчитывают не менее 20 полей зрения в разных частях фильтра на
общей площади 20 000 мкм
2
.
В каждом поле зрения производят подсчет 4 маленьких квадратов, расположенных по диагонали. При меньшей плотности бактерий считают в 4 или 16 квадратах вместе, увеличив при этом число
учитываемых полей зрения. Расчет общего количества бактерии
производят по формуле
6
10SN
Х=
SV
где S – фильтрующая площадь аппарата, мм2;
N – среднее число микроорганизмов в одном квадрате;
S1 – площадь квадрата окулярного сетчатого микрометра, мкм2;
V – объем пробы воздуха, л;
106 – переводный коэффициент (мм2 в мкм2).
6
Отношение
10SS
– величина постоянная для данного микро-
1
,
1
скопа, одного и того же улавливателя микроорганизмов, при использовании одинакового окуляра, объектива и сетки. При отсутствии сетки можно считать на всей площади поля зрения микроскопа не менее 10 полей зрения.
Определение коли-индекса воздуха. Сущность метода заклю-
чается в фильтрации улавливающей жидкости через фильтр, находящийся в улавливателе, и концентрировании микроорганизмов
на поверхности фильтра, выращивании их при 37,5 °С на среде
* Микрометрическая сетка размерами 8×8 мм, один квадрат 0,5×0,5 мм. Площадь одного квадра-
та равна 250 000 мкм2, площадь всей сетки 64 000 000 мкм2, всего квадратов (16×16) – 256.
111
Эндо, дифференцировании выросших колоний и подсчете количества бактерий группы кишечных палочек в определенном объеме
воздуха.
Проба воздуха берется по методике, описанной выше, и достав-
ляется в лабораторию.
В лаборатории осуществляется фильтрация улавливающей
жидкости через фильтр, расположенный в емкости. В результате
фильтрации улавливающей жидкости микроорганизмы концентрируются на поверхности фильтра. После
фильтрации мембрану
осторожно приподнимают за край фломбированным пинцетом и
переносят на среду Эндо в чашках Петри, не допуская образования
пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.
На одну чашку можно поместить не более 4 фильтров, причем таким образом, чтобы они не соприкасались друг с другом.
Посевы инкубируют в термостате 16–20 часов при температуре 37 °С. При обнаружении на фильтре колоний, характерных для
кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском),
их подсчитывают. В случае необходимости подтверждают их
принадлежность к бактериям группы кишечной палочки путем
определения оксидазной активности и посева на полужидкую
среду с глюкозой.
Оксидазную активность определяют путем наложения мембранного фильтра стороной с выросшими колониями вверх на
кружок фильтровальной бумаги, обильно смоченной реактивом
(2,5 мл 1 %-ного спиртового раствора -нафтола и 7,5 мл 1 %-ного
водного раствора фенилендиаминового соединения: диметил-nфенилен-диамина, диметил-n-фенилдиамина хлорида). Колонии
бактерий, обладающие оксидазной активностью, изменяют через
2–4 минуты цвет на сине-фиолетовый и учету не подлежат. Положительной считается реакция, которая проявляется в течение 5 минут. Темно-красный цвет бактерий рода Escherichia на среде Эндо
препятствует проявлению сине-фиолетовой окраски.
Результаты подсчета выражают коли-индексом, который определяется количеством колоний кишечных палочек, выросших на
поверхности фильтра, с пересчетом этого количества на 1 л воздуха.
Например: на поверхности фильтра выросло 10 колоний, объем
взятой пробы воздуха 2 л. Коли-индекс равен 10 : 2 = 5.
112
Качество улавливания и точность определения микроор-
ганизмов. Взятие пробы воздуха с помощью предлагаемого нами
улавливателя микроорганизмов обеспечивает высокое качество
улавливания за счет: ударного действия воздушной струи в жидкость; осаждения микроорганизмов в конической емкости под
действием гравитации; использования бактериального фильтра.
Состав задерживаемых микроорганизмов определяется характеристикой фильтров, используемых в улавливателе.
определении количества микроорганизмов путем высева
При
улавливающей жидкости учитываются только жизнеспособные
клетки микроорганизмов, т. е. те из них, которые способны размножаться на данной среде и в определенных условиях их культивирования.
Этот метод позволяет учесть не только численность микроорганизмов в определенном объеме воздуха, но и оценить их разнообразие по морфологии колоний. Точность метода зависит от числа
подсчитанных колоний, а не от числа повторностей. Если число
выросших колоний меньше 10, то эти результаты не учитывают и
при расчете количества микроорганизмов в пробе воздуха не используют.
Метод прямого счета микробных клеток на бактериальном
фильтре под микроскопом дает возможность определить численность микроорганизмов наиболее полно. Однако при этом учитываются как живые, так и мертвые клетки и потому общее число
бактерий в 5–6 раз больше, чем при подсчете числа колоний на мясопептонном агаре. Плотность распределения бактерий на фильтре
должна быть в пределах 10–30 клеток на один квадрат. Плотность
распределения бактерий на фильтре регулируется количеством забираемого воздуха.
Оценивая точность метода, следует отметить, что он не дает полного учета всего микробного пейзажа воздушной среды. Часть микроорганизмов, наиболее мелких, при увеличении в 1350 раз остается не
подсчитанной. Число подсчитанных бактерий прямым методом возрастает при использовании микроскопов с большим увеличением.
Ошибка метода может быть обусловлена субъективным учетом
не только бактерий, но и других аэрозольных частиц, содержащихся
в воздухе. Для получения сравнимых результатов необходимо использовать одну и ту же микроскопическую технику, так как при
различном увеличении микроскопа меняется субъективное воспри-
113
ятие бактериальных клеток и аэрозольных частиц даже у одного и
того же исследователя. Средняя ошибка метода определяется разницей между несколькими определениями одной пробы.
Достоинством метода мембранных фильтров для определения
микроорганизмов группы кишечной палочки является возможность концентрирования микрофлоры из различных объемов воздуха непосредственно в емкости улавливателя.
6.5. Определение общей численности различных
видов микроорганизмов
Определение сапрофитных бактерий.
Общая бактериальная обсемененность воздуха, или микробное
число, – это суммарное количество микроорганизмов, содержащихся
в 1 м3 воздуха. Для определения общего количества бактерий в воздухе закрытых помещений забирают две пробы (объемом по 100 л
каждая) на чашки Петри с МПА при помощи любого прибора (чаще
всего аппарата Кротова) либо седиментационным методом, расставляя чашки с питательной средой по принципу конверта. Чашки с
посевом помещают в термостат на сутки, а затем на 48 часов оставляют при комнатной температуре. Экспозиция чашек с посевами на
свету дает возможность подсчитать раздельно количество пигментных колоний (желтых, белых, розовых, черных, оранжевых и др.),
количество спорообразующих бацилл, грибов и актиномицетов.
Подсчитывают количество колоний на обеих чашках, вычисляют среднее арифметическое и делают перерасчет на количество
микроорганизмов в 1 м3 воздуха. Бациллы образуют колонии, как
правило, крупные, круглые, с неровными краями, сухие, морщинистые. Колонии грибов с пушистым налетом (Мисоr и Aspergillus)
и плотные – зеленоватые или сероватые (Penicillium). Актиноми-
цеты образуют беловатые колонии, вросшие в агар. Количество
каждой группы колоний (пигментных, беспигментных, плесеней,
бацилл, актиномицетов) выражают в процентах по отношению к
общему числу.
При определении микробного числа методом седиментации по
Коху подсчитываются колонии, выросшие на МПА в чашках Петри, и расчет ведется по В. Л. Омелянскому. Если придерживаться
этой методики, на чашку площадью 100 см2 за 5 минут оседает
такое количество микробов, которое содержится в 10 л воздуха.
114
Определение патогенных микроорганизмов.
Ввиду малой концентрации патогенных микроорганизмов в
воздухе закрытых помещений их выделение является достаточно трудной задачей.
Делались попытки найти косвенные показатели загрязнения
внешней среды патогенными микроорганизмами. Для этих целей
оказалось возможным использовать микроорганизмы, постоянно
обитающие в организме человека и животных (толстом отделе кишечника и верхнем отделе
дыхательных путей). Такие микроорганизмы были названы санитарно-показательными. В основном
они являются комменсалами и только при изменении условий проявляют условно-патогенные свойства.
Из постоянных обитателей толстого отдела кишечника в качестве санитарно-показательных микроорганизмов приняты следующие: бактерии группы кишечных палочек, энтерококки, сульфитредуцирующие анаэробы (преимущественно Cl. perfringens),
бактерии рода Proteus, кишечные бактериофаги; из постоянных
обитателей слизистых оболочек верхнего отдела дыхательных путей стрептококки (зеленящий стрептококк Streptococcus viridans
и гемолитический стрептококк Streptococcus haemolyticus); стафилококки гноеродный, или золотистый – Staphylococcus pyogenes
(aureus).
При расшифровке внутрибольничных инфекций определяют в
воздухе присутствие стафилококков, стрептококков, синегнойной
палочки, сальмонелл, протеев и др. Отбор проб воздуха производят с помощью ПАБ-1 в объеме не менее 1000 л. Посев производят
на соответствующие элективные среды. Если используется жидкая
среда как улавливающая жидкость, то пробирку с жидкостью помещают в термостат на сутки для подращивания (получение накопительной культуры), а затем высевают на элективную среду.
При исследовании воздуха на наличие микобактерий туберкулеза отбор проб производят с помощью прибора ПОВ-1 в объеме
250–500 л воздуха. В качестве улавливающей жидкости берут среду
Школьниковой, которую затем обрабатывают 3 %-ным раствором
серной кислоты (для подавления сопутствующей микрофлоры) и
центрифугируют. Осадок засевают в пробирки на одну из яичных
сред, чаще среду Левенштейна – Иенсена. Инкубируют при 37 °С
до 3 месяцев. Отсутствие роста в течение 3 месяцев дает возможность выдать отрицательный ответ. Пробирки первый раз просма-
115
тривают через 3 недели, затем каждые 10 дней. Выделенную культуру идентифицируют, определяют ее вирулентность (заражением
морских свинок – биопроба) и при необходимости определяют
устойчивость к лекарственным препаратам.
При определении в воздухе коринебактерий дифтерии для по-
сева воздуха используют чашки со средой Клауберга.
В последние годы определяют в атмосферном воздухе в райо-
нах дождевания
земледельческих полей, при орошении их сточными водами, сальмонеллы в случае появления заболевания
среди персонала станций орошения или населения. Отбор проб
производят с помощью аппарата Кротова на чашки с висмутсульфитным агаром. Исследуют не менее 200 л воздуха. Выделенная культура идентифицируется по обычной схеме определения сальмонелл.
Определение стафилококков.
Стафилококки являются одним из наиболее распространенных
микроорганизмов в воздухе закрытых помещений, что обусловливается значительной устойчивостью их к различным факторам
окружающей среды. Обнаружение патогенных стафилококков в
воздухе закрытых помещений имеет санитарно-показательное значение и свидетельствует об эпидемическом неблагополучии. Отбор проб воздуха проводится с помощью аппарата Кротова в количестве 250 л на 2–3 чашки с молочно-желточно-солевым агаром
(или молочно-солевым, желточно-солевым) и на чашку с кровяным агаром. Чашки инкубируют при температуре 37 °С в течение
48 часов. Изучают культуральные признаки всех видов колоний, из
подозрительных готовят мазки и окрашивают по Граму. Помимо
качественной характеристики отдельных колоний, подсчитывают
количество выросших колоний стафилококков в 1 м3 воздуха.
Бактериальные инфекции, вызываемые стафилококками, характеризующиеся преимущественно гноеродными процессами
различной локализации, проявляются в виде абсцессов, флегмон,
маститов, метритов, пневмоний, сепсиса. Токсигенные штаммы
стафилококков могут вызвать пищевые отравления у людей.
Возбудители стафилококкозов в основном штаммы S. aureus,
реже S. epidermidis и некоторые другие виды рода Staphylococcus,
семейства Micrococcaceae.
Лабораторная диагностика стафилококкозов основана на результатах бактериологического исследования.
116
Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки
окрашивают по Граму и на капсулу, микроскопируют. Клетки стафилококков грамположительные, сферической формы, диаметром
0,5–1 мкм, располагаются в виде скоплений неправильной формы,
а также единично, парами и цепочками из трех-четырех микротел,
спор нет, вирулентные штаммы могут образовывать капсулу.
Культуральные свойства. Стафилококки – факультативные
анаэробы, температурный
оптимум 30–37 °С, рН 7,2–7,4, к питательным средам неприхотливы, могут расти при повышенном
содержании хлорида натрия. Исследуемый материал высевают
на МПА, в МПБ, посевы культивируют в условиях обычной атмосферы. При загрязнении материала посторонней микрофлорой
используют питательные среды с селективными свойствами: солевые МПА, МПБ (8–10 % хлорида натрия), желточно-солевой агар
(ЖСА), 3,5 %-ный МПА с добавлением 3 мл 0,1 %-ного раствора
кристаллвиолета (на этой среде патогенные стафилококки образуют колонии фиолетового или оранжевого цвета). Широко используют посев исходного материала на кровяной МПА.
На плотных средах через 18–24 часа инкубирования вырастают
колонии правильной круглой формы, выпуклые, с гладкой поверхностью, ровными краями, диаметром 2–7 мм, непрозрачные. Цвет
колоний зависит от типа вырабатываемого пигмента. Staphylococcus
aureus синтезирует золотистый и белый пигмент. На кровяном МПА
вирулентные штаммы обычно растут, формируя широкую зону гемолиза. На ЖСА вокруг колоний стафилококков, обладающих лецитиназной активностью, образуются зоны помутнения с перламутровым оттенком. В МПБ рост стафилококков сопровождается интенсивным помутнением среды и образованием значительного осадка.
Из культур, выросших на питательных средах, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении бактерий с типичными для стафилококков культуральноморфологическими признаками приступают к изучению свойств,
прямо или косвенно свидетельствующих о патогенности выделенного стафилококка.
Патогенные стафилококки в отличие от непатогенных образуют
капсулу (S. aureus), выделяют гемолизин, фибринолизин (стафи-
локиназу), гиалуронидазу, плазмокоагулазу, желатиназу, ДНК-азу,
лецитиназу, ферментируют маннит. Важнейшим из перечисленных
факторов считают плазмокоагулазу: у 90–95 % плазмокоагулирую-
117
щих стафилококков выражена способность продуцировать энтеротоксин.
Биопроба. Заражают лабораторных животных для подтвержде-
ния токсигенных свойств выделенного стафилококка.
Энтеротоксин продуцируют токсигенные штаммы. Пробу на
энтеротоксин ставят при отравлениях. Культуру стафилококка
выращивают на специальной питательной среде (пептон, хлорид
натрия, хлорид магния, дигидрофосфат калия, 0,8 % агар-агара,
рН 7,2), в атмосфере, содержащей 20 % оксида углерода (IV), в
течение трех суток. Затем культуру стерилизуют фильтрованием, 10–15 мл фильтрата смешивают с равным объемом молока и
скармливают 4–8-недельным котятам. При наличии энтеротоксина через 1–2 часа у животных возникают симптомы гастроэнтерита и рвота.
Для идентификации стафилококков применяют их фаготипирование.
Определение стрептококков.
Стрептококки также являются санитарно-показательными микроорганизмами воздуха. Отбор проб воздуха при исследовании
на наличие а- и р-гемолитических стрептококков производят с помощью аппарата Кротова на чашки с кровяным агаром, средами
Гарро и Туржецкого. Забирают 200–250 л воздуха, чашки с посевами выдерживают в термостате 18–24 часов и затем еще 48 часов
при комнатной температуре (после предварительного просмотра и
учета). Идентификацию проводят по общепринятой методике.
Стрептококки встречаются в полости рта, носа, в глотке и кишечнике животных и человека. Обычно присутствие их в организме безвредно, но в некоторых случаях отдельные виды стрептококков могут вызывать заболевания верхних дыхательных путей
и гнойничковые поражения десен и кожи. Род Streptococcus содержит 29 видов. S. pyogenes – возбудитель ряда заболеваний.
Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, выделение чистой культуры посевом на питательные
среды или методом биопробы, идентификацию возбудителя по
культурально-морфологическим, ферментативным, серологическим и патогенным признакам (постановкой биопробы).
Микроскопия препаратов из исходного материала. Мазки окра-
шивают по Граму и на капсулу, микроскопируют. Все страфило-
118
кокки представляют собой сферические или овальные грамположительные клетки диаметром 0,5–1,25 мкм, без спор и жгутиков с
тенденцией к образованию цепочек различной длины. Морфология
стрептококков некоторых видов в препаратах из патологического
материала несколько отличается. У S. pneumoniae клетки обычно
парные, окруженные капсулой концевые части клеток слегка удлинены, поэтому данный стафилококк ранее называли
ланцетовидным диплококком. Клетки S. pneumoniae также могут располагаться единично и короткими цепочками. S. equi в мазках из гноя
обнаруживают в виде длинных цепочек, причем клетки в цепочке
как бы сплющены в горизонтальной плоскости, образуют капсулу;
в мазках из культуры клетки S. equi чаще располагаются короткими
цепочками, единично, парами. S. agalactiae и S. pyogenes в препара-
тах из материала чаще обнаруживают в виде цепочек.
Выделение и идентификация культуры возбудителя. Стрептококки – факультативные анаэробы, температурный оптимум 37 °С.
На общепринятых питательных средах растут плохо, обычно используют обогащенные среды: МПБ с 1 % глюкозы и 10 % инактивированной сыворотки крови лошади, МПА с 1 % глюкозы и 5 %
крови барана или кролика. Для выделения культуры возбудителя
исследуемый материал высевают на указанные питательные среды
и культивируют 18–24 часа.
На глюкозо-кровяном МПА все виды патогенных стрептококков образуют мелкие колонии, чаще с зоной гемолиза.
У S. pneumoniae колонии круглые, полупрозрачные, плоские, с
приподнятым центром и краями, с зоной гемолиза типа «альфа»;
в МПБ растет с равномерным помутнением среды. S. equi формирует мелкие, росинчатые, слизистые, правильной круглой формы
колонии с узкой зоной β-гемолиза, позднее они становятся серобелыми, непрозрачными; в МПБ растет с помутнением среды,
образованием пушистых хлопьев, через 3–5 суток культивирования бульон просветляется, на дне пробирки образуется осадок.
У S. agalactiae (S. dysagalactiae) мелкие, сероватые, просвечивающие колонии с β- или двойной зоной α-гемолиза, при росте в
МПБ среда остается прозрачной, формирующиеся крупинки оседают на дно пробирки. S. pyogenes на кровяном МПА образует
мелкие, прозрачные, правильной круглой формы колонии с зоной
β-гемолиза, в бульоне растет с просветлением среды и выпадением зернистого осадка.
119
На следующем этапе из выделенных культур готовят мазки,
окрашивают по Граму, микроскопируют. При обнаружении типичных по морфологии и тинкториальным свойствам клеток бактерий
переходят к следующему этапу.
Чтобы исключить стафилококковую, энтерококковую (род Entero-
coccus) инфекции, чистую культуру исследуют в нескольких пробах.
Ставят тест на каталазу – стафилококки образуют каталазу, стрептококки нет
. С целью дифференциации пиогенных гемолитических
стрептококков от энтерококков культуры высевают в МПБ, содержащий 40 % желчи крупного рогатого скота, МПБ с 6,5 % хлорида
натрия. Энтерококки в отличие от гноеродных стрептококков растут
на этих средах. Также проверяют чув ствительность клеток культуры к желчи: в пробирку с МПБ, содержащим 10 % желчи крупного рогатого скота, вносят 0,5 мл исследуемой суточной бульонной
культуры и выдерживают при 37 °С 1 час. При лизисе содержимое
пробирки просветляется, энтерококки не лизируются.
Серогрупповую принадлежность выделенного микроба определяют в реакции преципитации. В РП используют стрептококковые
групповые преципитирующие сыворотки. Исследуемую культуру
выращивают в МПБ в течение 18–20 часов, затем 7–9 мл культуры
центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют 0,3–0,4 мл 0,2 н раствора соляной кислоты, осадок суспендируют, взвесь прогревают в кипящей водяной бане 10 минут, охлаждают,
добавляют каплю 0,04 %-ного спиртового раствора фенолфталеина
и нейтрализуют 0,2 н раствором гидроксида натрия. Жидкость приобретает бледно-розовый цвет. Затем смесь вновь центрифугируют и
надосадочную жидкость, содержащую термостабильный полисахаридный антиген С, используют как антиген для постановки реакции
кольцепреципитации. По классификации Ленсфильд стрептококки
на основании антигенных свойств полисахарида С: можно отнести к
той или иной серологической группе: А, В, С, D и т. д. S. pneumoniae
не содержит серогрупповой полисахарид, но является антигенногетерогенным видом, который дифференцируют на типы в РА.
Биопроба. У выделенных культур стрептококков определяют па-
тогенные свойства в биопробе на белых мышах. Для заражения используют только свежевыделенные штаммы в виде 18 –20-часовых
бульонных культур, которые по 0,5 мл вводят внутрибрюшинно
трем мышам. Культу ру признают патогенной при гибели не менее
двух мышей.
120
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]