Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Санитарная микробиология. Учебное пособие
.pdf
Методика индикации количественного определения микро-
организмов в воздухе с помощью улавливателя
УЛАВЛИВАТЕЛЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
Устройство обладает повышенной эффективностью улавливания
микроорганизмов. Это достигается тем, что воздух просасывается через улавливающую жидкость в циклон, на выходе которого установлен
фильтр, способствующий отделению и задержке микроорганизмов. Последние смываются с поверхности фильтра улавливающей жидкостью.
Улавливатель (рис. 5, 6) состоит
из емкости 1, имеющей форму
конического циклона, в нижней части которого находится улавливающая жидкость 2, а в верхней части под сеткой 3 устанавливает-
ся фильтр 4, который с помощью эластичного вкладыша 5 прижимается крышкой 6. В средней части циклона, на уровне поверхности улавливающей жидкости, имеется жиклер 7, расположенный
под углом к жидкости, с запрещающим приспособлением 8.
Для проведения исследований емкость улавливателя частично
заполняется улавливающей жидкостью и устанавливается фильтр.
Улавливание микроорганизмов осуществляется следующим образом. Включение насоса создает разрежение воздуха в емкости
1 улавливателя, обеспечивает поступление в нее исследуемого воздуха через жиклер 7. Воздух, проходя через отверстие 7 жиклера,
попадает в улавливающую жидкость 2, затем поднимается вверх
по циклону 1 и через фильтр 4 отсасывается наружу.
Рис. 5. Схема улавливателя
микроорганизмов
Рис. 6.
Улавливатель микроорганизмов
101
Взвешенные частицы и микроорганизмы задерживаются в улавливающей жидкости, оседают на внутренней поверхности емкости
улавливателя. Микроорганизмы, не отделившиеся от воздуха, задерживаются фильтром и концентрируются на его поверхности
непосредственно в улавливателе. После определенного периода
работы бактериоулавливатель отсоединяется от насоса. Отверстие
жиклера закрывается.
Микроорганизмы, находящиеся на внутренней поверхности
фильтра и стенок емкости
улавливателя, смываются улавливающей
жидкостью путем плавного поворачивания емкости улавливателя.
Предлагаемый улавливатель по сравнению с аппаратом Кротова
имеет следующие преимущества:
а) улавливание микроорганизмов осуществляется в жидкость,
а не на плотную питательную среду;
б) осаждение микроорганизмов осуществляется в емкости, име-
ющей коническую форму. Из уравнения Бернулли о неразрывности следует, что в местах сужения трубопровода скорость
течения жидкости и газа возрастает, а давление понижается.
В циклоне под действием гравитации происходит отделение
взвешенных частиц и микроорганизмов. По известному техническому решению, осаждение микроорганизмов осуществляется в чашку Петри, имеющую цилиндрическую форму;
в) на выходе воздушного потока из улавливателя установлен
фильтр, который задерживает микроорганизмы, в последующем смывающиеся улавливающей жидкостью.
В сравнении с другими улавливателями, основанными на фильтрации воздуха через жидкости, растворимые вещества (прибор
Дьяконова, Киктенко, улавливатели Соколинского), фильтры (прибор Милявской), предлагаемый улавливатель позволяет осуществлять двойную фильтрацию воздуха: на входе через улавливающую
жидкость и на выходе через фильтр, а также осаждение микроорганизмов в конической емкости под действием гравитации.
Несмотря на то что предлагаемый улавливатель содержит некоторые элементы известных приборов (фильтр, улавливающую
жидкость, емкость), он отличается от них определенным (схемным) взаимоположением структурных элементов, обеспечивающим поэтапное выделение микроорганизмов из воздушного потока
и создание закрытой камеры, исключающей возможность контакта
их с наружным воздухом.
102
Использование улавливателя без жидкости снижает пропускную способность фильтра. При аспирации воздуха в режиме 5 л/
мин, через 5–7 минут наблюдается снижение пропускной способности фильтра на 9–10 %, в то время как при наличии улавливающей жидкости аналогичного снижения пропускной способности
фильтра не наблюдалось. Это объясняется тем, что предварительное улавливание пылевых частиц жидкостью
уменьшает степень
закупориваемости фильтра. Использование устройства без фильтра не обеспечивает полного улавливания и сохранения микроорганизмов. Кроме того, предлагаемое устройство позволяет улавливать из воздушного потока аэрозоли различной дисперсности.
Натурные испытания, которые проводились с целью выяснения
возможности улавливания микроорганизмов из воздушной струи с
помощью разработанного улавливателя, показали:
а) включение аспиратора обеспечивает поступление через жиклер в емкость улавливателя воздуха, который, ударяясь об улавливающую жидкость, меняет направление и затем через фильтр
отсасывается наружу;
б) улавливатель микроорганизмов может работать в различных
технологических режимах фильтрации воздуха: когда верхний
уровень жидкости находится выше калиброванного отверстия и
ударного действия воздушной струи и когда уровень жидкости находится ниже калиброванного отверстия;
в) испытуемое устройство обеспечивает улавливание микроорганизмов, содержащихся в воздухе, за счет фильтрации его через
жидкость и фильтр. Состав задерживаемых микроорганизмов зависит от размеров и определяется характеристикой фильтров, используемых в улавливателе.
Результаты исследований по определению эффективности различных устройств для микробиологического анализа воздуха представлены в таблице 8.
Как видно из таблицы 8, во всех опытах концентрация микроорганизмов, установленная с помощью предлагаемого устройства,
значительно выше, чем с помощью аппарата Кротова.
Повышение качества улавливания микроорганизмов мы объясняем наличием некоторых положительных эффектов у предлагаемого устройства и отсутствием их у известного (аппарата Кротова). Это, прежде всего, наличие фильтра, который задерживает
микроорганизмы, отделяя их от газовой фазы. Состав задерживае-
103
мых микроорганизмов определяется характеристикой фильтров,
используемых в улавливателе. Размещение фильтра на последнем
этапе движения воздушного потока обеспечивает заключительную
фильтрацию воздуха и сохранение микроорганизмов, исключая
возможность их контакта с наружным воздухом.
Таблица 8
Сравнительные данные определения концентрации
микроорганизмов различными устройствами
№
п/п
Предлагаемое (улавливатель
микроорганизмов)
1
Известное (аппарат Кротова) 4 57,8±8,5
Предлагаемое 5 227,4±29,6
2
Известное 4 31,1± 8,5
Предлагаемое 6 607,8±59,4
3
Известное 5 83,9±7,3
Предлагаемое 4 197,0±20,9
4
Известное 4 57,6±7,5
Устройство
Кол-во проб
воздуха
5 337,2±17,6
Кол-во
микроорга низмов
в 1 л
Способы и устройства для микробиологического анализа воздуха, основанные на осаждении микроорганизмов на поверхность
плотной питательной среды (метод Коха, чашечный импактор Андерсена, аппарат Кротова и др.), имеют один общий недостаток:
результаты анализа не отличаются особой точностью в связи с тем,
что посев микроорганизмов на поверхность плотной питательной
среды осуществляется в процессе взятия пробы воздуха. При инкубировании некоторые бактериальные клетки, находящиеся на
поверхности аэрозольных частиц, не контактируют полностью с
питательной средой и остаются в «дремлющем» состоянии, не образуя колоний. У других образование видимых колоний не происходит в связи с тем, что количество питательного раствора, способного диффундировать в клетки, расположенные на поверхности
аэрозольных частиц, ограничено, а их запас в непосредственной
близости быстро истощается. В результате определенная часть микроорганизмов остается не учтенной, что и влияет на результаты
исследований. Необходимо также иметь в виду, что при улавли-
104
вании или осаждении микроорганизмов на плотную питательную
среду, культивировании и подсчете видимых колоний учитывается
количество аэрозольных частиц, а не микробных клеток. Аэрозольная частица может быть нагружена микроорганизмами, но
при выращивании образуется одна колония. Поэтому данные, полученные с помощью аппарата Кротова, дают весьма относительное представление о содержании в воздухе
аэрозольных частиц, а
не микробных клеток. Аэрозольная частица может быть нагружена микроорганизмами, но при выращивании образуется одна колония. Поэтому данные, полученные с помощью аппарата Кротова,
дают весьма относительное представление о содержании в воздухе
аэрозольных частиц, а не микробных клеток.
Таким образом, результаты исследований, полученные с помощью улавливателя микроорганизмов, наиболее объективно отражают содержание микробных клеток в определенном объеме воздуха.
Высокая точность обусловлена не только более качественным
улавливанием, но и тем, что при анализе воздуха используется не
плотная среда, а улавливающая жидкость.
Улавливание аэрозольных частиц и выделение их из газовой
смеси осуществляется различными методами, путем использования гравитационных, центробежных, инерционных и электростатических сил, методом термодиффузии, аспирации и фильтрации.
В качестве улавливающей основы может использоваться питательный гель, жидкость, фильтры, предметные стекла, смазанные вазелином, капли пара или жидкости.
Известно много классификаций методов микробиологического
исследования воздуха (А. И. Шафир, 1945; С. С. Речменский, 1951;
В. М. Никитин, 1964; В. С. Киктенко и др., 1968; В. В. Влодавец,
1972; В. С. Ярных, 1972; Н. М. Руденко и В. Л. Евдокимов, 1975).
В их основу положен механизм улавливания биологических аэрозолей в зависимости от среды, в которой осуществляется улавливание.
Классификация, предложенная Н. М. Руденко и В. Л. Евдокимовым (1975), является более удобной, поскольку она учитывает
основной признак – каким образом (с помощью того или иного
прибора) можно характеризовать аэрозоль: содержанием в единице объема воздуха бактериальных клеток или количеством аэрозольных частиц, загруженных этими элементарными образованиями.
105
Методы определения количества аэрозольных частиц, со-
держащих микроорганизмы.
1. Инерционная импакция частиц на поверхность питательного
геля:
– с фракционной характеристикой;
– без фракционной характеристики;
– осаждение на поверхность питательного геля в электриче-
ском или тепловом поле;
– задержка фильтрами с наложением на поверхность пита-
тельного агара для проращивания;
– определение аэрозольных частиц с помощью
электрической
аппаратуры.
2. Методы определения количества микробных клеток:
– инерционная импакция в жидкость с фракционной и без-
фракционной характеристикой;
– отбор путем барботажа, сифонирования жидкости, жидкост-
ных циклонов;
– задержка нерастворимыми фильтрами с последующей де-
зинтеграцией частиц в жидкости;
– задержка частиц растворимыми фильтрами.
3. Комбинированные методы, основанные на использовании
одновременно различных механизмов улавливания.
Отделение аэрозольных частиц с помощью центробежных сил
осуществляется в циклонах, которые представляют собой цилиндрическую, заканчивающуюся снизу конусом камеру. Воздух подается тангенциально в верхнюю часть циклона и, продолжая вращаться, удаляется через выходную трубку. Под действием центробежных сил крупные частицы отбрасываются к стенкам камеры и
опускаются в улавливающую жидкость, находящуюся в циклоне.
Методы инерционного осаждения основаны на использовании
кинетической энергии, приобретаемой аэрозольной частицей при
прохождении ее через сопло. Воздух при помощи насоса с большой
скоростью прокачивается через сопло, затем сталкивается с осадительной поверхностью, расположенной перпендикулярно потоку.
Выделение аэрозольных частиц с помощью электростатических сил
основано на способности заряженных частиц перемещаться в электрическом поле. Для задержки частиц используют коронный разряд, создаваемый при высоком напряжении. Электростатический осадитель состоит из иглообразного коронирующего и осадительного электродов.
106
При выделении аэрозольных частиц можно использовать тепловую диффузию газов. Если частицы пыли находятся между
теплой и холодной поверхностями, то они движутся и осаждаются на холодной. Сила, действующая на пылевую частицу в поле
температурного градиента, пропорциональна диаметру частицы,
температурному градиенту и уменьшается с ростом теплопроводности вещества частицы.
Метод фильтрования
основан на пропускании через фильтрующие материалы определенного объема исследуемого воздуха при
помощи аспирационного устройства. В качестве фильтрующих
материалов используют бумажные фильтры, фильтры из тонковолокнистого материала, стекловолокна. Возможно различное конструктивное выполнение фильтров. Метод отличается высокой
представительностью пробы и длительностью пробоотбора.
При аспирации воздуха через жидкости путем барботажа, сифонирования происходит осаждение непосредственно в жидкость
или питательную среду.
Методы, основанные на принципе осаждения бактериальных
аэрозолей паром или распыленной жидкостью, характеризуются
высокой эффективностью улавливания, а улавливающая жидкость
может быть использована для посева на различные элективные
среды, заражения лабораторных животных.
В ветеринарной практике широко используется простейший
метод, который основан на оседании бактериальных частиц и капель под влиянием силы тяжести на поверхность агара открытой
чашки Петри и модификация его, предложенная В. Ф. Матусевичем (1964). Чашки с МПА (мясопептонным агаром) экспонируют
5–10–15 минут (в зависимости от степени обсемененности), инкубируют в термостате и через 24 и 48 часов подсчитывают количество выросших колоний. Пересчет осуществляют по Омельянскому, исходя из того, что на поверхность 100 см2 агара оседает
за 5 минут такое количество бактерий, которое содержится в 10 л
воздуха. Этот метод малопригоден, так как не дает объективного
количественного представления о содержании микроорганизмов
Необходимое оборудование и реактивы: улавливатель микроорганизмов, бактериальные фильтры (мембраны типа МФА-МА № 5,
6, 7 с диаметром 35 мм), электрический аспиратор, микроскоп, вакуумнасос или водоструйный, шприц Жанэ, водяная баня, пипетки; чашки Петри, колба Бунзена; питательные среды (мясопептонный агар,
107
среда Эндо), эритрозин, фенол, фильтровальная бумага, -нафтол,
диметил-n-фенилендиамин, физиологический раствор.
Принцип индикации основан на улавливании микроорганизмов в емкость с улавливающей жидкостью, отделении аэрозольных частиц от газовой фазы и последующей концентрации их в
улавливающей жидкости либо на поверхности фильтра.
Схема и варианты лабораторного анализа воздуха:
1. Взятие пробы
воздуха и отделение микроорганизмов от газо-
вой фазы с помощью улавливателя.
2. Смывание микроорганизмов с поверхности фильтра улавли-
вающей жидкостью.
3. Посев улавливающей жидкости на плотные питательные среды.
4. Постановка биологической пробы или серологических реакций.
5. Концентрация микроорганизмов на поверхности мембранно-
го фильтра путем фильтрации улавливающей жидкости.
6. Прямой подсчет микроорганизмов на поверхности фильтра.
7. Наложение фильтра на поверхность плотной питательной среды
(среды Эндо) для проращивания и определения коли-индекса воздуха.
Подготовка прибора и взятие пробы воздуха. Подготовка
улавливателя к работе заключается в его стерилизации путем кипячения в течение 20 минут. Фильтры типа МФА-МА, проверенные
на отсутствие трещин, отверстий, помещают по одному на поверхность дистиллированной воды, нагретой до 80–90 °С в химическом
стакане. Затем воду медленно доводят до кипения на слабом огне и
кипятят 10–15 минут. При бурном кипении происходит сворачивание фильтров, поэтому на дно сосуда, в котором кипятят фильтры,
помещают сетчатую пластинку из нержавеющей стали. После кипячения фильтры переносят в чашку Петри и слегка подсушивают в термостате. Хранят фильтры в 40 %-ном спирте или 4 %-ном
формалине в банке с притертой пробкой, чтобы предотвратить развитие микроорганизмов и загрязнение.
В емкость улавливателя заливается 3 мл стерильного физиологического раствора, который используется как улавливающая жидкость. Количество улавливающей жидкости, вносимой в емкость
улавливателя, должно быть оптимальным (3 мл). Нужно, чтобы
верхний уровень ее соответствовал жиклеру. Жидкость не должна
истекать из отверстия жиклера.
С соблюдением стерильности в верхней части улавливателя
устанавливается простерилизованный и высушенный в термоста-
108
те фильтр, затем сетка, прокладка, которые плотно прижимаются
крышкой. Отверстие жиклера должно быть закрыто.
Улавливатель микроорганизмов устанавливается в помещении,
где предполагается взятие пробы воздуха.
Взятие пробы воздуха осуществляется с помощью электроаспиратора в режиме 3 л/мин. При отсутствии аспиратора проба воздуха в объеме 1–2 л берется с помощью шприца Жанэ.
Включение
аспиратора создает разряжение воздуха в емкости
улавливателя. Открывание жиклера обеспечивает поступление в
емкость исследуемого воздуха. Воздух, проходя через отверстие
жиклера с большой скоростью, попадает в улавливающую жидкость, образуя брызги, затем поднимается вверх и через фильтр
отсасывается наружу. Микроорганизмы задерживаются в улавливающей жидкости, оседают на внутренней поверхности емкости
улавливателя. Микроорганизмы, не отделившиеся от воздуха, задерживаются фильтром и концентрируются на его поверхности непосредственно в улавливателе. После взятия пробы воздуха улавливатель микроорганизмов отсоединяют от аспиратора. Отверстие
жиклера перекрывается, и проба доставляется в лабораторию.
Микроорганизмы, находящиеся на внутренней поверхности
фильтра и стенок емкости улавливателя, смываются улавливающей жидкостью путем переворачивания емкости улавливателя и
тщательного взбалтывания.
Определение количества микроорганизмов путем посева
улавливающей жидкости. Посев улавливающей жидкости осу-
ществляется в расплавленный и остуженный до температуры 45 °С
мясо-пептонный агар в чашки Петри. Сначала в чашку стерильной
пипеткой вносится улавливающая жидкость, затем выливается
агар и все перемешивается. Объем высеваемой жидкости составляет 1 мл. Из каждой пробы воздуха делается 2–3 параллельных
высева. Необходимо стремиться к тому, чтобы число колоний на
чашке Петри не превышало 200–250. При большем числе колоний
трудно осуществлять их детальную характеристику.
Чашки Петри с агаром помещают в термостат для выращивания
колоний при температуре 37,5 °С на 24 часа.
Подсчитывают количество выросших колоний, не открывая
чашки Петри. Результаты параллельных высевов суммируются
и определяется среднее число колоний, выросших при высеве из
данной пробы воздуха.
109
После подсчета колоний определяют количество микроорганизмов, содержащихся в определенном объеме воздуха, с учетом
общего количества улавливающей жидкости и количества взятого
для исследования воздуха.
Расчет ведут по формуле
АВ
М =
,
ДС
где М – количество живых микробных клеток, содержащихся в 1 л воздуха;
А – общее количество улавливающей жидкости;
В – количество колоний, выросших на питательной среде после по-
сева улавливающей жидкости;
С – количество воздуха, содержащегося в пробе;
Д – количество жидкости, высеваемой на мясопептонный агар.
Пример. При взятии 5 л воздуха и высеве 1 мл улавливающей
жидкости после инкубирования выросло 185 колоний.
М =
3 185
= 111 микробных тел в 1 л воздуха.
15
Определение количества микроорганизмов путем прямого
счета на мембранном фильтре. Сущность метода заключается в
концентрировании на мембранном фильтре микроорганизмов из
пробы воздуха, окрашивании их карболовым эритрозином непосредственно на фильтре и подсчитывании под микроскопом с помощью окулярной сетки.
Проба воздуха, взятая по методике, описанной выше,
доставля-
ется в лабораторию.
В условиях стерильного бокса улавливатель микроорганизмов
подсоединяется к вакуумному насосу. Для осуществления фильтрации улавливающей жидкости через фильтр, расположенный
в емкости, улавливатель переворачивают вверх дном и штуцер
крышки через пробку подсоединяют к колбе Бунзена. Последняя
подсоединяется к вакуумному насосу. В результате фильтрации
улавливающей жидкости микрофлора концентрируется на поверхности фильтра с мелкопористой сеткой-площадкой.
После фильтрации фильтр извлекается из улавливателя и помещается на фильтровальную бумагу для высушивания на воздухе или в
термостате. Окраску фильтров осуществляют раствором карболового
эритрозина (5 г краски на 100 мл 5 %-ного водного раствора фенола).
110
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]