Производственный микробиологический контроль на предприятиях молочной отрасли. Лабораторный практикум. Учебное пособие

стрептококков), содержание свободных аминокислот в молоке повышают с 10 до 60 мг%. Lbm. casei subsp. rhamnosum в от-

личие от Lbm. plantarum образует СО2 из цитрата натрия. Стрептобактерии играют положительную роль при созре-

вании многих сыров, так как они могут размножаться в них после ферментирования лактозы и при содержании поваренной соли с массовой долей до 6 %.

Бета-бактерии характеризуются слабой энергией кислотообразования и молоко не сквашивают. При добавлении дрожжевого автолизата к молоку размножение бета-бактерий ускоряется и предельная кислотность может достигнуть 150 - 160 °Т.

Бета-бактерии в молоке образуют незначительное количество летучих кислот, углекислый газ, этиловый спирт, молочную кислоту. Ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа, мальтозу, рибозу, фруктозу и др. Большинство видов образуют аммиак из аргинина. Бета-бактерии не свертывают лакмусовое молоко и лишь частично его восстанавливают (порозовение). Имеют очень слабую терморезистентность, могут развиваться в среде, содержащей NaCl с массовой долей 4 %.

Гетероферментативные бета-бактерии участвуют в созревании твердых сыров с низкой температурой второго нагревания, способствуют образованию рисунка и формированию запаха сыра.

Порядок выполнения работы

1. Приготовить разведения чистых культур молочнокислых бактерий.

Разведение чистой культуры делают в том случае, если предполагается посев микрофлоры на плотные питательные среды методом розлива посевного материала.

В пробирку со стерильной водой в асептических условиях вносится стерильной бактериологической петлей капля накопительной или чистой культуры. Пробирка закрывается в пламени спиртовки. Вращением, а затем легким ударом о ладонь руки содержимое пробирки перемешивается.

31

2. Произвести посевы чистых культур или их разведений на жидкие или плотные питательные среды:

∙гидролизованное молоко;

∙гидролизованный молочный агар с мелом;

∙гидролизованный молочный агар с лимоннокислым кальцием;

∙мясо-пептонный желатин;

∙углеводную среду с индикатором ВР;

∙стерильное молоко и молоко с метиленовым синим. Посев микрофлоры чистой культуры молочнокислых бак-

терий на жидкие питательные среды - гидролизованное молоко, стерильное молоко, среду с индикатором ВР – произвести бактериологической петлей.

Посев микрофлоры на МПЖ сделать уколом в столбик желатина.

Посев на плотные питательные среды произвести пипеткой (1/3 см3) в чашку Петри с последующим заливом гидролизованным молочным агаром.

При выполнении посева микрофлоры соблюдать асептические условия среды.

Посевы микрофлоры культивировать в термостате при соответствующих температурах для данного микроорганизма, только тогда будут проявляться свойства этого микробв.

Посев МПЖ не термостатируется, так как желатин разжижается при температуре выше 25 ºС.

3. Изучить биологические свойства представленных культур молочнокислых бактерий.

Морфологические свойства путем микроскопирования окрашенных мазков, приготовленных из исследуемой колонии. При этом отмечаются форма микробных клеток, характер их расположения, наличие спор, капсул (окрашивание по Граму). Наличие жгутиков определяют путем исследования культур на подвижность в препаратах “висячая” и “раздавленная” капля, а также путем посева культуры на полужидкий мясо-пептонный агар (подвижные бактерии вызывают помутнение агара, а неподвижные растут по месту уклона).

32

Метод микроскопирования. Основан на визуальном наблюдении микроорганизмов с помощью приборов (микроскопов), позволяющих многократно увеличивать подготовленный исследуемый объект.

При микроскопическом исследовании учитываются как жизнеспособные, так и нежизнеспособные клетки микроорганизмов, при этом чувствительность метода - не менее 105 клеток в 1 см3 или 1 г исследуемого продукта.

Для приготовления препарата жидкого продукта на чистое предметное стекло наносят петлей каплю продукта и распределяют на площади 1-2 см2.

Для приготовления препарата из творога, творожных продуктов, творожных сырков, сырных и альбуминных паст на стекло наносят каплю воды, вводят в нее петлей исследуемый материал, тщательно перемешивают и растирают на площади 1-2 см2.

Для приготовления препарата из твердых продуктов - сыр, сырные продукты и т.д. их тщательно растирают со стерильной водой в стерильной ступке. Затем полученную массу петлей на-

носят на чистое предметное стекло и распределяют на площади 1- 2 см2.

При исследовании колоний микроорганизмов, выросших на твердых питательных средах (агаровая культура), часть колонии отбирают с помощью бактериологической петли или иглы и тщательно растирают в капле воды на предметном стекле.

Приготовленные микропрепараты высушивают при комнатном температуре на воздухе.

Для закрепления клеток микроорганизмов на стекле высушенные микропрепараты фиксируют. Для этого предметное стекло с высушенным микропрепаратом, обращенным вверх, берут пинцетом и проводят 3-5 раз через верхнюю часть пламени горелки с промежутками в 5-6 с. Зафиксированный микропрепарат охлаждают на воздухе.

Окрашивание микропрепарата метиленовым голубым. За-

фиксированный микропрепарат помещают на подставку для окраски мазком вверх. Пипеткой наносят рабочий раствор метиленового голубого так, чтобы покрыть весь мазок, по истечении 30-

33

60 с краситель осторожно сливают. Препарат промывают водой. Окрашенный мазок высушивают на воздухе.

Окрашивание микропрепарата по Граму. Зафиксирован-

ный микропрепарат помещают на подставку для окраски мазком вверх, накладывают полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор кристаллического фиолетового. Окраску проводят в течение 1-2 мин.

Снимают бумагу, сливают избыток красителя и, не промывая препарат водой, наливают раствор Люголя на 1-2 мин до почернения препарата.

Раствор Люголя сливают. Предметное стекло погружают несколько раз в этиловый спирт. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости.

Микропрепарат тщательно промывают водой.

Повторную окраску микропрепарата проводят водноспиртовым раствором фуксина в течение 2 мин.

Просушенный микропрепарат помещают на предметный столик микроскопа и просматривают микропрепарат, используя иммерсионную систему. Микроскопирование препаратов дрожжей и плесневых грибов допускается проводить с меньшим увеличением без использования иммерсионной системы.

Ориентировочный состав микрофлоры кисломолочных продуктов в микропрепаратах определяют по таблице.

34

Культуральные свойства по характеру роста микробной культуры на плотной и жидкой питательных средах. Характер роста на плотной питательной среде изучают с подробным описанием формы, величины, цвета, поверхности, консистенции, краев и структуры колоний, образованных на плотной среде.

35

При изучении роста бактерий в жидкой среде описывают степень помутнения среды, наличие поверхностной пленки, пристеночного кольца, осадка, изменение цвета питательной среды.

Помутнение может быть сильным, незначительным, при легком встряхивании иногда появляются в среде так называемые “муаровые волны”. Питательная среда может также оставаться прозрачной.

Поверхностная пленка может отсутствовать или быть нежной, тонкой, толстой, грубой, морщинистой.

Пристеночное кольцо бывает хорошо или слабо выраженным, узким, широким. Осадок может быть незначительным или обильным, рыхлым, хлопьевидным или плотным.

Цвет питательной среды может изменяться вследствие образования пигментов микроорганизмами, которые имеют различный цвет: красный, сине-зеленый и др.

Биохимическая активность микробов чрезвычайно разнообразна. Она зависит от характера и количества тех ферментов, которые микробная клетка продуцирует и выделяет во внешнюю среду.

При изучении свойств молочнокислых бактерий определяют ряд свойств, имеющих большое значение для молочной промышленности, - активность кислотообразования, предельную титруемую кислотность, качество сгустка, способность сбраживать цитраты, образование черырехуглеродных соединений.

Активность кислотообразования определяют по времени образования сгустка, при посеве культуры в стерильное обезжиренное молоко в количестве одна капля (одна петля) на 10 см3 молока при термостатировании в условиях, оптимальных для данного вида культуры.

Предельную кислотность микроба (в ºТ) определяют принятым методом титрования (КОН, индикатор фенолфталеин) после культивирования в течение 7 сут в обезжиренном молоке при оптимальной температуре.

Типичный кислотный сгусток – ровный, плотный, гомогенный без отделения сыворотки, его вкус кисловатый, приятный.

36

Оформление отчета

1. Результаты исследования занести в таблицу.

Контрольные вопросы и задания

1.Как и какие морфологические свойства микроорганизмов изучают?

2.Что собой представляют культуральные свойства микро-

бов?

3.Назовите биохимические свойства микроорганизмов.

4.Каковы особенности изучения свойств молочнокислых

37

бактерий, предназначенных для промышленного применения (в составе заквасок)?

5.Какие питательные среды применяют для изучения свойств молочнокислых бактерий?

6.В чем состоит сущность идентификации микроорганиз-

мов?

7.Какие свойства изучаемого микроорганизма необходимо знать для его идентификации?

Лабораторная работа № 3

ОСВОЕНИЕ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ САНИТАРНО–ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

И МИКРООРГАНИЗМОВ ПОРЧИ

Цель работы: освоить методы определения санитарнопоказательных микроорганизмов (ГОСТ Р 53430-2009) и микроорганизмов порчи – дрожжей и плесневых грибов (ГОСТ

10444.12 - 88).

Материальное обеспечение: мясо-пептонный агар, селек-

тивная агаризованная среда - БФ, среда Кесслер по 50 см3, микроскоп, стекла предметные и покровные, спиртовка, петли бактериологические, термометры, термостаты на 24, 30, 37 °С, стерильные пробирки, пипетки на 10, 2, 1 см3, дистиллированная вода, краски для окрашивания микробиологических препаратов, фильтровальная бумага, чашки Петри.

Теоретические сведения

При санитарно-микробиологическом исследовании решают вопрос о наличии или отсутствии в пищевых продуктах и других объектах внешней среды опасных для человека микроорганизмов. Прямое обнаружение возбудителей инфекционных болезней имеет целый ряд трудностей. Во-первых, патогенные микроорганизмы находятся в окружающей срeде непостоянно; сравнительно

38

легко их можно обнаружить во время эпидемии, но очень трудно - в межэпидемические периоды. Во-вторых, количеств патогенных микроорганизмов, попавших в окружающую среду, значительно уступает непатогенным, и распространение их в загрязненных объекта неравномерно. Трудности возникают и при выращивании патогенных микробов на питательных средах, поскольку их развитие подавляется сапрофитной микрофлорой.

В связи с этим санитарную оценку различных объектов проводят не прямым, а косвенным путем, т. е. устанавливают факт загрязнения этих объектов не возбудителями кишечных инфекций, а кишечными выделениями человека или теплокровных животных. Чем обильнее загрязнение, тем более вероятно попадание в объект патогенных микробов.

Для многих видов микробов (обитателей тела здорового человек кишечник является биотопом − единственной природной средой обитания, и выявление таких микробов вне организма свидетельствует о загрязнении внешней среды выделениями из кишечника и возможном присутствии патогенных микробоввозбудителей кишечных инфекций. Выделяемые в этих случаях микробы служат показателями санитарного неблагополучия потенциальной опасности исследуемых объектов и потому названы санитарно-показательными.

Санитарно-показательные микроорганизмы являются обитателями естественных полостей человеческого или животного организма. При изменении условий сосуществования с хозяином они могут вызывать болезнетворные процессы, т. е. проявлять условно-патогенные свойства.

Они должны отвечать следующим требованиям: постоянное содержание в фекалиях и постоянное поступление в окружающую среду в больших количествах; отсутствие другого природного резервуара, кроме организма человека и животных; сохранение жизнеспособности в окружающей среде в течение сроков, близких к срокам выживания патогенных микробов, выводимых из организма теми же путями; устойчивость должна быть не ниже, а по возможности несколько выше устойчивости соответствующих патогенных микробов; отсутствие размножения в окружающей среде; простота обнаружения, они должны хорошо расти на ис-

39

кусственных питательных средах и не иметь во внешней среде аналогов-сапрофитов, сходство с которыми потребовало бы сложных и многочисленных приемов дифференцирования; постоянство свойств: они не должны изменяться под воздействием факторов внешней среды; отсутствие зависимости от наличия других микроорганизмов, не подавляться и не стимулироваться другими микроорганизмами; равномерное распределение в исследуемых объектах внешней среды.

Бактерии группы кишечных палочек являются самыми распространенными санитарно-показательными микроорганизмами, однако в качестве показателя фекального загрязнения используются также и другие постоянные обитатели кишечника человека и животных - энтерококки, споровый анаэробный микроорганизм - Cl. Perfringens, палочка протея, кишечные бактериофаги и др.

При исследовании молока существенными свойствами снижающими санитарно-показательную ценность микроорганиз- мов-индикаторов, является их способность размножаться в молоке и подавляется молочнокислыми бактериями закваски и проявляет при этом изменчивость биологических свойств.

Во многих стандартах на молочные продукты наряду с определением санитарно-показательных микроорганизмов в качестве косвенного показателя санитарного состояния продукта и санитарно-гигиенических условий производства учитывают общую бактериальную обсемененность продуктов, оборудования и других объектов, т. е. определяют количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных бактерий, или показатель КОЕ (колониеобразующие единицы).

При эпидемических показаниях (например, пищевых отравлениях) органы санитарно-эпидемического надзора проводят исследования для непосредственного обнаружения патогенных микроорганизмов (сальмонелл и др.).

Порядок выполнения работы

1. Освоить метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в сыром и питьевом пастеризованном молоке.

40