Производственный микробиологический контроль на предприятиях молочной отрасли. Лабораторный практикум. Учебное пособие

тотеновая (В3), никотиновая (РР), фолиевая (В9) кислоты, пиридоксин (В6) и др.

Лактококки, как и большинство молочнокислых бактерий, культивируют на обезжиренном стерильном молоке или на плотных и жидких искусственных питательных средах с использованием гидролизованного молока и других питательных веществ, получаемых из молока.

При развитии лактококков в молоке они вызывают его свертывание, т. е. образование ровного, без обильного отделения сыворотки плотного сгустка, имеющего приятные кисломолочные вкус и запах. Ароматобразующий лактококк образует сгусток, в котором можно обнаружить в небольшом количестве пузырьки углекислого газа.

При росте на гидролизованном молоке лактококки вызывают помутнение питательной среды.

На агаре с гидролизованным молоком и мелом они образуют мелкие (0,5 - 1 мм) каплевидные колонии с ровным краем и зонами просветления мела. Зоны просветления вокруг колоний обусловлены превращением (под действием молочной кислоты) нерастворимого углекислого кальция в растворимый лактат кальция. Колонии в толще питательной среды (глубинные колонии) имеют форму лодочки или зерна чечевицы (см. рис. 1, 2).

Лактококки растут в средах с низким значением рН - от 5,5 до 8,8, некоторые - при рН 2,9 - 3,2.

Биохимические свойства лактококков изучают по энергии кислотообразования, предельной кислотности, способности ферментировать соли лимонной кислоты, по качеству сгустка, возможной протеолитической активности бактерий и др.

Энергию (интенсивность) кислотообразования определяют по времени образования сгустка молока (кислотность около 58 - 60 °Т) при внесении 0,5 см3 молодой (12 - 20-часовой) культуры в 10 см стерильного обезжиренного молока и выращивании посевов при оптимальной температуре.

Качество сгустка определяют тотчас после его образования. Лактококки образуют ровный, плотный, гомогенный кислотный сгусток; без отделения сыворотки; с кисловатым, приятным вкусом. Если сгусток стягивается с отделением сыворотки, то это дает основание предположить наличие в молоке сычужного фермента, выделяемого маммококками (Enterococcus faecalis var.

21

liquefaciens) и микрококками, бактериями группы кишечных палочек или дрожжами.

Лактококки обладают различной ферментативной активностью. Они ферментируют углеводы с образованием L (+)-молочной кислоты, но, как правило, без газа.

Lac. lactis является активным кислотообразователем. Его штаммы свертывают молоко за 4 - 7 ч, предельная кислотность достигает 120 °Т. Восстанавливает и свертывает лакмусовое молоко, не образует ацетоина, разлагает аргинин с образованием аммиака. Не развивается в щелочной среде при рН 9,5. Заключительная рН в жидких средах с глюкозой составляет 4,0 - 4,5.

Lac. lactis образует кислоту из галактозы, глюкозы, мальтозы и лактозы. Не ферментирует рабинозу, ксилозу, сахарозу, трегалозу, салицин, инулин, глицерол , сорбитол и низин.

Lac. lactis применяют в многоштаммовых заквасках совме-

стно с Lac. cremoris, Lac. diacetylactis и видами рода Leuconostoc.

В молочной промышленности его широко используют при производстве кисломолочных продуктов, кисло-сливочного масла, сыров.

Lac. cremoris в отличие от молочного лактококка не сбраживает мальтозу и декстрин, не растет при температуре 9 - 40 °С. При пониженных температурах культивирования (15 - 20 °С) некоторые штаммы образуют значительное количество летучих кислот, восстанавливают и свертывают (иногда только частично) лакмусовое молоко. Имеются слизеобразующие штаммы, формирующие вязкие сгустки молока. Их используют в заквасках для производства сметаны.

Энергия кислотообразования у Lac. cremoris слабее, чем у Lac. lactis. и составляет 6 - 8 ч, а предельная кислотность - 110 - 115 °Т.

Lac. cremoris используют преимущественно там, где необходимо добиться вязкой консистенции, умеренного кислотообразования. Он входит в состав заквасок для сметаны, творога, масла, сыров.

Ароматобразующий лактококк Lac. diacetylactis продуцирует фермент цитритазу, которая расщепляет цитраты с образованием диоксида углерода (СО2) и ароматических веществ - ацетоина и диацетила.

22

Lac. diacetylactis - сравнительно слабый кислотообразователь, имеет слабую энергию кислотообразования (более 16 ч), предельная кислотность в молоке достигает 70 - 100 °Т.

Сгусток молока содержит пузырьки газа (СО2). Образование диоксида углерода может быть необходимым или нежелательным. Для получения глазков во многих видах сыра образование СО2 необходимо. С другой стороны, оно не должно быть настолько сильным, чтобы обусловливать пороки рисунка сыра. В кисломолочных напитках присутствие диоксида углерода в известной степени улучшает вкус (легкий пикантный привкус).

При развитии ароматобразующего лактококка сгусток молока имеет специфический запах, обусловленный накоплением диацетила (собственно ароматического вещества), который имеет особое значение для ароматизации масла. Он также желателен как ароматизирующий компонент в сливках, пахте и различных сортах свежего сыра.

Оптимальной температурой ароматообразования для

Lac. diacetylactis является 25 °С.

Lac. diacetylactis в качестве заквасочного микроорганизма используют при производстве молочных продуктов, в которых желательно сильное кислото - и ароматообразование, например, для приготовления масла, творога, сметаны, простокваши и разных сортов свежего сыра.

2. Лейконостоки. В молочной промышленности имеет значение вид Leu. mesenteroides, он включает три подвида: Leu. mesenteroides subsp. dextranicum (сокращенно - Leu. dextranicum); Leu. mesenteroides subsp. cremoris (Leu. cremoris) и Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides (Leu. mesenteroides).

Морфология. Лейконостоки имеют сферические, несколько вытянутые клетки размером (0,5-0,7 × 0,7-1,2) мкм. Располагаются парами или цепочками. По Граму красятся положительно, неподвижные, спор не образуют.

Leu. cremoris имеет клетки, которые обычно выстраиваются в длинные двойные цепочки.

Культуральные свойства. Лейконостоки являются факультативными анаэробами. Растут на специальных питательных средах. Оптимальная температура роста 20 - 30 °С, а минимальная составляет 5 °С.

23

Молоко является бедной питательной средой для развития лейконостоков. Большинство штаммов растет в молоке при добавлении ростовых факторов, экстракта дрожжей и глюкозы.

Лейконостоки на плотных средах образуют мелкие (до 1 мм в диаметре) гладкие круглые серовато-белые колонии (рис. 3); на средах, содержащих сахарозу, образуют мелкие слизистые колонии. При посеве лейконостоков уколом на плотную среду развиваются вдоль укола с небольшим поверхностным ростом. Бульонные культуры часто имеют однородное помутнение, но штаммы, образующие длинные цепочки, имеют тенденцию к образованию осадка.

Рис. 3. Leuconostoc mesenteroides: а – круг-

лые плотные колонии; б - кокковая форма, круглые клетки, окруженные слизью

Биохимические свойства. Лейконостоки являются хемоорганотрофами с облигатной потребностью в сбраживаемом углеводе. Они ферментируют глюкозу с образованием кислоты и обычно газа; основными продуктами брожения являются также этанол D (-)-изомер молочной кислоты и ароматические вещества - диацетил, ацетоин и 2,3-бутиленгликоль.

Лейконостоки являются слабыми кислотообразователями, молоко часто не свертывают, протеолитической активностью не обладают, индол и аммиак не образуют, нитраты не восстанавливают. Конечную рН при росте в жидкой среде с глюкозой дово-

дят до 4,4 - 5,0.

Leu. mesenteroides subsp. dextranicum является слабым ки-

слотообразователем, свертывает молоко через 2 - 3 сут. Предельную кислотность доводит до 70 - 80 °Т.

24

Leu. mesenteroides subsp. cremoris медленно развивается в молоке и его не сквашивает, так как предельная кислотность достигает только 40 - 50 °Т.

Leu. cremoris и Leu. dextranicum с наибольшим эффектом ароматообразования используют в многоштаммовых заквасках в сочетании с Lac. lactis или Lac. cremoris или обоими вместе.

Применение Leu. cremoris наиболее целесообразно там, где необходимо получить мягкий долговременный аромат, например, в производстве стойкого к хранению масла.

Leu. dextranicum вместе с другими ароматобразующими стрептококками чаще вводят в состав заквасок для сыров.

3. Термофильный стрептококк. Систематика. В

род Streptococcus входит один вид молочнокислых кокков - Streptococcus thermophilus (термофильный стрептококк). Он образует в небольшом количестве ацетоин, поэтому занимает промежуточное положение между гомо- и гетероферментативными стрептококками. В связи с этим его относят к факультативным, или среднегетерогенным, гетероферментативным молочнокислым стрептококкам.

Морфология. Str. thermophilus представляет собой грамположительные шарообразные или эллипсовидные клетки диаметром 0,7 - 0,9 мкм, чаще располагающиеся длинными цепочками. По величине клетки крупнее, чем клетки молочного стрептококка. Термофильный стрептококк спор и капсул не образует, неподвижен.

Культуральные свойства. По отношению к кислороду

Str. thermophilus, как и все молочнокислые бактерии, является факультативным анаэробом. Хорошо растет на обезжиренном и гидролизованном молоке, также на плотных средах, содержащих компоненты молока и ростовые факторы.

На поверхности плотных питательных сред термофильный стрептококк образует очень мелкие колонии округлой формы с зернистой структурой и локонообразными краями, глубинные колонии имеют чечевицеобразную форму с боковыми выростами.

Характерным признаком Str. thermophilus является широкий диапазон температур роста - от 20 до 50 °С. Оптимальной является температура 37 - 40 °С, слабый рост наблюдается при 50 °С, температура 53 °С задерживает рост.

25

Биохимические свойства. Str. thermophilus no энергии ки-

слотообразования превосходит все молочнокислые стрептококки, достигая уровня термофильных лактобактерий. Он сквашивает молоко через 3,5 - 6 ч, предельная кислотность составляет

110 - 115 °Т.

4. Лактобактерии. Молочнокислые палочки (лактобак-

терий) относят к семейству Lactobacteriaceae, роду Lactobacterium,

включающему три подрода: Thermobacterium (термобактерии), Streptobacterium (стрептобактерии) и Betabacterium (бетабакте-

рии).

Морфологические свойства. Лактобактерии представ-

ляют собой палочки размером (4-15 × 0,5-0,6) мкм, встречаются изогнутые и булавовидные формы (коринеформы), также короткие коккобактерии. Они, как правило, неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму красятся положительно. Клетки стрептобактерий мельче, чем клетки термобактерий, часто располагаются в виде цепочек. Бета-бактерии имеют наиболее мелкие и тонкие клетки (рис. 4 - 8).

Рис. 4. Молочнокислые бактерии: а - Lactobacterium bulgaricum; б - Lactobacterium casei; в - Lactobacterium acidophilum и Streptococcus thermophilus: клетки, окруженные небольшим слоем слизи

Культуральные свойства. Молочнокислые палочки являются факультативными анаэробами или микроаэрофилами, лучше растут при пониженном содержании кислорода или в ат-

26

мосфере, содержащей 5 - 10 % СО2. Некоторые штаммы при выделении являются анаэробами. По отношению к температуре стрептобактерий и бета-бактерии являются мезофилами, термобактерии - термофилами.

Лактобактерий относятся к хемоорганотрофам. На обычных средах они не растут, их выращивают на средах с молоком. При развитии в молоке вызывают образование однородного плотного сгустка с приятным кисломолочным запахом и вкусом.

При росте молочнокислых бактерий в жидких средах (гидролизованное молоко) наблюдаются помутнение среды, осаждение клеток вскоре после прекращения роста. Осадок однородный и гомогенный, редко зернистый или слизистый. Поверхностная пленка никогда не образуется.

На плотных питательных средах (агар с гидролизованным молоком и мелом, МРС-агар, селективная среда ЛС) лактобактерий формируют округлые мелкие, размером 2 - 5 мм, гладкие блестящие колонии серо-белого цвета со сферической поверхностью. На гидролизованном агаре с мелом вокруг колоний образуется зона просветления мела. Колонии лактобактерий разных видов почти не различаются. Однако в некоторых случаях наблюдаются колонии шероховатые, волокнистые, врастающие в субстрат. Эти колонии с шероховатым краем относятся к R-формам в отличие от гладких колоний, относящихся к S-формам

(см. рис. 5 – 8).

Биохимические свойства. Лактобактерии находятся на границе аэробного и анаэробного типов дыхания. Они обладают эффективным метаболизмом ферментации углеводов и аминокислот, который связан с субстратным фосфорилированием, т.е. ферментативным присоединением фосфата к органическому веществу. Вторым уровнем фосфориляции является преобразование карбамидфосфата в СО2 и NH3. Заключительным этапом фосфорилирования является ферментация аргинина, наблюдаемая у большинства гетероферментативных лактобактерии. Однако только некоторые виды, образующие аммиак из аргинина, способны расти на аргинине как единственном источнике энергии. Среди термобактерий в качестве заквасочных микроорганизмов чаще применяют Lbm. helveticum (швейцарская палочка), Lbm.

27

delbrueckii subsp. bulgaricum (болгарская палочка), Lbm. acidophilum (ацидофильная палочка), Lbm. delbrueckii subsp. lactis (мо-

лочная палочка).

Рис. 5. Lactobaсterium helveticum: a - колония с локоновидно-

разветвленным краем; б - длинные палочки

Термофильные молочнокислые палочки являются активными кислотообразователями, они сквашивают молоко через 4 - 5 ч, предельная кислотность достигает 200 - 350 °Т.

Lbm. helveticum является самым активным кислотообразователем, предельная кислотность при его развитии достигает 350 °Т. Эта палочка может сбраживать, кроме лактозы, глюкозы, галактозы, фруктозу, маннозу, ксилозу, мальтозу и декстрин, не сбраживает сахарозу, раффинозу, салицин. Некоторые штаммы развиваются в субстратах с массовой долей поваренной соли до 5 %.

Штаммы Lbm. helveticum можно выделить из сычуга телят или кислого сырого молока. Микроорганизмы используют в составе заквасок для твердых сыров с высокой температурой второго нагревания.

Lbm. delbrueckii subsp.bulgaricum (см. рис. 4) доводит пре-

дельную кислотность молока до 200 - 300 °Т. Штаммы болгарской палочки образуют ацетальдегид ароматическое вещество, придающее вкус, запах, подавляющее нежелательную

28

микрофлору кишечника. Болгарская палочка чувствительна ко многим антибиотикам, устойчива к бактериофагу.

Рис. 6. Lactobacterium acidophilum: a - по-

верхностная колония; б - длинные палочки, сгустки казеина, ацидофильное молоко

Рис. 7. Lactobacterium plantarum: a - маленькие, гладкие, блестящие колонии; б - шероховатые колонии с разветвленным краем

Ее штаммы выделяют, как правило, из сырого молока. Применяют в составе заквасок для производства простокваши мечниковской, южной, йогурта, ряженки и др.

Lbm. acidophilum является кишечным микробом, который можно выделить из содержимого пищеварительного тракта человека и различных животных. Ацидофильная палочка способна после культивирования в молоке вновь приживаться в кишечнике человека и подавлять там развитие патогенных и нежелательных микроорганизмов (сальмонеллы, шигеллы, стафилококки, эшерихии и др.). Антагонистическое действие Lbm. acidophilum

29

обусловлено продуцируемыми антибиотиками - ацидофилином и лактоцидином.

Предельная кислотность ацидофильной палочки достигает 200 - 250 °Т. Lbm. acidophilum ферментирует сахарозу, мальтозу, салицин, часто раффинозу, декстрин. Имеются слизеобразующие штаммы ацидофильной палочки.

Рис. 8. Lactobacterium brevis: a - круглые колонии со слегка зазубренным краем; б - короткие палочки; в – короткие палочки, располагающиеся цепочками

Lbm. delbrueckii subsp. lactis no своим свойствам и поведе-

нию в закваске проявляет большое сходство с болгарской палочкой. Она сбраживает глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, галактозу, декстрин и салицин. Предельная кислотность молока, сквашенного молочной палочкой, достигает 120 - 180 °Т, используется в сыроделии.

Стрептобактерии обладают менее выраженной кислотообразующей способностью. Они ферментируют молоко через 2 - 3 сут, предельная кислотность составляет 180 °Т.

Для молочной промышленности имеют значение стрепто-

бактерии Lbm. plantarum и Lbm. casei subsp. rhamnosus. Они спо-

собны усваивать, кроме лактозы, также соли молочной кислоты (лактаты), растут в гидролизованном молоке, содержащем NaCl с массовой долей 6 % и желчи с массовой долей 20 %, восстанавливают и свертывают лакмусовое молоко и не образуют аммиак из аргинина. Обладают высокой протеолитической активностью (в 2 раза выше, чем у мезофильных молочнокислых

30