книги из ГПНТБ / Современное состояние жидкостной хроматографии

главах). В этом диапазоне коэффициентов распределения наблю­ дается оптимальное разрешение пиков (как функции времени ана­ лиза). Кроме того, пики относительно острые, что обеспечивает хорошую чувствительность детектирования. Оптимальный диапа­ зон коэффициентов распределения получают обычно в результате подбора полярности подвижной фазы.

Насколько важен этот параметр показывает рис. 5.13. В дан­ ном случае — разделение примесей в 3-формилрифампине в ко-

лонке с неподвижной фазой зипакс/полиамид оптимальной по­ движной фазой является смесь 75% гексана/25% этанола. Этот состав позволяет детектировать примеси, концентрация которых очень мала и в то же время позволяет проводить точные опреде­ ления сильнополярного основного компонента высокого молеку­ лярного веса.

в. Чтобы оптимизировать эффективность колонки, нужно вы­ бирать такие неподвижные и подвижные фазы, которые будут обеспечивать наибольший коэффициент диффузии.

г. Разрешение компонентов образца должно определяться в первую очередь тщательным выбором жидко-жидкостной системы, имеющей наибольший фактор разрешения для веществ в смеси; однако эффективность колонки должна быть оптимизирована так, чтобы анализ проводился возможно быстрее и чтобы пики были достаточно острыми, что обеспечит максимальную чувствитель­ ность детектирования.

2. Применение жидко-жидкостной хроматографии

Количественный анализ. Методом ЖЖХ можно проводить рутинный точный количественный анализ образцов [26]. При про­ ведении количественных измерений в образец добавляют внутрен-

Жидко-жидкостная хроматография 151

ний стандарт и измеряют отношение площадей, используя обыч­ ные методики газовой хроматографии. Если для измерения пло­ щади пиков используется электронный интегратор, обычное от­ клонение может быть меньше 0,5% [26]. (Используя для ввода образца краны высокого давления, которые позволяют вводить воспроизводимо очень малые пробы, можно уменьшить необхо­ димость во внутренних стандартах, применяемых в количествен­ ных анализах.) Эти результаты не отражают предела точности,

с которой могут осуществляться анализы методом ЖЖХ. При использовании усложненных приборов и вычислительных устройств воспроизводимость анализа равна и превышает самую высокую воспроизводимость, достигнутую в ГХ.

Анализ следов. Методом ЖЖ Х может также осуществляться анализ компонентов, содержащихся в образцах в следовых коли­ чествах, хотя чувствительность измерений при этом в значитель­ ной степени зависит от используемого детектора. В жидко-жид­ костных хроматографических колонках можно анализировать образцы большого объема, так как это не приводит к значитель­ ному уширению пика, но в этом случае возможности использо­ вания данного образца часто ограничены пределом чувствитель­

метр), можно измерять малые количества компонентов. Некоторые ультрафиолетовые детекторы имеют значительную чувствитель­ ность, позволяющую измерять пики в нано- и пикограммовом диапазоне. Рис. 5.14 показывает, что 10 нг диурона [3-(3,4-дихлор- фенил)-1,Гдиметилмочевина, поглощаемость 88 л/г-см при 254 нм]

152 Глава 5

легко детектируется, если в колонку аликвотно вводится образец объемом 100 мкл [27]. Высокоскоростная Ж Ж Х используется для анализа следов осадков органофосфорных ларвицидов на поверх­ ности воды [28].

Программирование скорости потока. В разделении методом Ж Ж Х иногда можно успешно применить программирование скорости по­

рекомендуется. На практике довольно трудно добиться установле­ ния равновесия между носителем и неподвижной фазой, т. е. та­ кого состояния, когда неподвижная жидкая фаза не вытекает из колонки. Преимущества, которые могут быть достигнуты при тем­ пературном программировании, незначительны и обычно не идут в сравнение с экспериментальными трудностями.

Градиентная подача растворителя. Эта гибкая методика не практикуется в стандартной ЖЖХ. Увеличение полярности при градиентном элюировании приводит к большей растворимости подвижной фазы; в результате по мере возрастания полярности подвижной фазы потери подвижной фазы увеличиваются. Однако эту методику можно считать вполне приемлемой, если исполь­ зовать насадки с химически связанными неподвижными фазами. Поскольку связанные неподвижные фазы не удаляются при изме­ нении полярности подвижной фазы, то эти насадки можно при­ менять в таких системах, в которых полярность используемой под-

Жидко-жидкостная хроматография 153

вижной фазы меняется в широком диапазоне. Кроме того, исполь­ зуя насадки со связанной фазой для градиентной подачи раство­ рителя, не нужно предварительно приводить в состояние равно­

фактором разделения при работе с большой эффективностью, ана­

в гл. 1, колонки с поверхностно-пористыми или тонкослойно-пори­ стыми насадками, как правило, обладают большими потенциаль­ ными возможностями. На рис. 5.15 показано разделение метоксихлора и его аналога, которое длится менее чем 60 с, разреше­ ние равно 2,8. На той же самой колонке длиной 24 см разделение

этого типа работ, ставших возможными после разработки хими­ чески связанных насадок, является доступность очень стабильных колонок с высоким разрешением. Методика жидко-жидкостных хроматографических анализов, несомненно, будет прогрессировать.

Препаративная жидко-жидкостная хроматография. Препара­ тивное разделение методом Ж Ж Х в принципе осуществимо, но прежде чем оптимизировать подходы к этой области, необходимо иметь больше информации о разрешении колонок с большим внут­ ренним диаметром. Если в колонках большого диаметра с очень высокой эффективностью использовать поверхностно пористые

то несмотря на то, что эти материалы имеют ограниченную емкость по образцу, можно выделить миллиграммовые количества компо­

силиконовые неподвижные фазы обычно не загрязняют выделяе­ мых фракций образца.

СП И С ОК Л И Т Е Р А Т У Р Ы

1.Martin А. 3. P., Synge R. L . М., Biochem. J., 35, 91 (1941).

2.Giddings J. С, Keller R. £., in Vol. I of Chromatographic Science Series»; «Dynamics of Chromatography*, Part I, «Principles and Theory*, Giddings J . C ,

Keller R. E . , eds, Marcell Dekker, New York, 1965.

3. Giddings J. C., Theoretical Basis of Partition Chromatography, in Chromatography*, 2nd ed., Heftman E., ed., Reinhold, New York, 1967.

4.Huber J. F. K., Liquid Chromatography and Columns, in Vol. 2B, Comprehensive Analytical Chemistry*, Wilson C. L. Wilson D. W., eds, Elsevier, Amsterdam, 1968.

N. H„ August 12, 1969.

7.Kirkland J. J., Anal. Chem., 41, 218 (1969).

8.Kirkland J. J., пат. США 3505785.

9.Snyder L . R., J. Chromatog. Sci., 7, 352 (1969).

10.van Niekerk F. A., Pretorious V., in «Advances in Gas Chromatography, 1967»,

Zlatkis A., ed., Preston Technical Abstracts Co., Evanston, 111., 1967, p. 167.

11.Kirkland J. J., unpublished studies.

12.Kirkland J. J., J . Chromatog. Sci., 7, 7 (1969).

13.Majors R. £., J. Chromatog. Sci., 8, 338 (1970).

23.Metzsch F. A. V., Angew. Chem., 65, 586 (1953).

24.Halasz /., Sebestian /., Angew. Chem., Intern. Ed., 8, 453 (1969).

25.Aue W. A., Hastings C. R., J. Chromatog., 42, 319 (1969).

26.Kirkland J. J., J. Chromatog. Sci., 7, 361 (1969).

27.Kirkland J. J., Anal. Chem., 40, 391 (1968).

28.Henry R. A., Schm.it J. A., Dieckman J. F., Symposium on Liquid Chromato­ graphy, American Chemical Fall Meeting, Chicago, 111., Sept. 15, 1970.

Глава 6

ТВЕРДО-ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Л.Снайдер

А. Введение

Современная жидкостная хроматография подразделяется на четыре различных метода: твердо-жидкостный (адсорбционный), жидко-жидкостный (распределительный), ионообменный и эксклюзионный (гель-проникающий и гель-фильтрующий). В данной главе рассматривается твердо-жидкостная хроматография.

Твердо-жидкостная хроматография в принципе является са­ мым ценным методом, однако до последнего времени она приме­ нялась гораздо реже трех остальных методов. В большей степени это связано с успехом тонкослойной хроматографии (ТСХ), ис­ пользуемой для разделения того же класса образцов. Тонкослой­ ная хроматография — простой и недорогой метод, часто позволяю­ щий проводить достаточно полное разделение чрезвычайно слож­ ных смесей, и в настоящее время многие исследователи имеют необходимый опыт для получения методом ТСХ достаточно хоро­ ших результатов.

Тем не менее адсорбционная хроматография имеет ряд потен­ циальных преимуществ в сравнении с ТСХ:

1)большая скорость и эффективность разделения (см., на­ пример, [1]);

2)возможность автоматизации процесса;

3)простота количественных измерений;

4)легкость увеличения масштаба для препаративного разде­

ления;

5)возможность использования для контроля процессов. Поэтому несомненно, что как только увеличится число иссле­

дователей, умеющих применять этот метод, он станет столь же широко распространенным, как и тонкослойная хроматография.

В каких случаях следует отдавать предпочтение ТЖХ? Оче­ видно, при выборе методики надо учитывать: приемлемость мето­ дики, собственное знание техники эксперимента, тип образца и селективность метода. Хотя первые два фактора имеют немало­ важное значение, но обычно выбор методики зависит главным образом от типа образца. ТЖХ хорошо подходит для многих соединений среднего молекулярного веса (т. е. относительно не­ летучих образцов с молекулярным весом < 1 ООО). К такому типу соединений относятся, в частности, растворимые масла. Если об­ разец можно анализировать методом ТСХ (например, см. [2]), то *

в воде соединений. ТЖХ менее приемлема для образцов высокого молекулярного веса (например, полимеров), а также ионных липофобных соединений.

В ряде случаев может потребоваться очень высокая селектив­ ность, т. е. а — 1 (см. гл. 1). ТЖХ обладает большей селектив­ ностью применительно к изомерам определенного типа, этим ме­ тодом можно также проводить успешное разделение соединений, отличающихся типом или числом функциональных групп. Однако

весом. В последующих разделах мы будем более подробно гово­ рить о селективности ТЖХ.

Б. Селективность в адсорбционной хроматографии

Разделение методом ТЖХ обычно проводится на полярных адсорбентах, таких, как силикагель, окись алюминия или другие неорганические твердые вещества. Основным фактором, опреде­ ляющим относительную адсорбцию молекул образца (т. е. зна­ чение k'), является наличие функциональных групп. Относитель­ ная адсорбция усиливается с увеличением полярности и числа функциональных групп, так как при этом усиливается взаимодей­ ствие между молекулой и полярной поверхностью адсорбента. Од­ нако то же самое можно сказать и о жидко-жидкостной хромато­ графии (распределительной), где увеличение числа и полярности групп в молекуле образца увеличивает время их удерживания в полярной жидкой фазе (обычно неподвижной фазе). Удержи­ вание в ЖЖХ и селективность в ТЖХ объясняются двумя осо­ бенностями, характеризующими адсорбцию из раствора: I) кон­ куренцией между молекулами образца и растворителя за место на поверхности адсорбента и 2) многократностью взаимодействий между функциональными группами молекулы образца и соответ­ ствующим жестко фиксированным местом на поверхности адсор­ бента.

числа п молекул растворителя /VI, первоначально содержащегося

с жидкостью (растворитель) полностью покрыта молекулами рас­ творителя или образца. Адсорбция X требует десорбции доста­ точного количества молекул растворителя, чтобы X мог распре-

дуальных функциональных групп и соответствующих молекул растворителя, замещающихся этими группами при адсорбции. В случае неполярных (слабых) растворителей энергия адсорбции заместителей алкильных групп будет приблизительно компенсиро­ ваться энергией адсорбции растворителя. С сильными раствори­ телями чистая энергия адсорбции алкильных групп будет отри­ цательной, т. е. адсорбция не будет происходить. В последнем случае алкильная группа свободно свисает наружу с поверхности адсорбента (т. е. происходит частичная десорбция), даже хотя остальная часть молекулы образца X адсорбируется. В случае и слабых и сильных растворителей суммарный результат мал или алкильные группы вообще не влияют на чистую энергию адсорб­ ции (и k') X. Это значит, что ТЖХ показывает малую селектив­ ность среди гомологов; избирательность по молекулярному весу отсутствует. Но в ТЖХ наблюдается резко выраженная тенденция к селективности по типу соединений, которая приводит к воз­ можности разделений по типу образца, как в анализе липидов [3] и нефти [4].

В табл. 6.1 перечислено несколько типов соединений, разде­ ление которых можно проводить методом ТЖХ. Все эти соедине­ ния содержат определенные функциональные группы или опре­ деленное число одних и тех же функциональных групп, сосредо­

Твердый адсорбент фиксирует на своей поверхности положение реакционноспособной группы или центра адсорбции. Взаимодей­ ствие соответствующих функциональных групп молекулы образца с этими центрами адсорбции будет меняться с геометрией моле­ кулы, становясь сильнее, когда положения группы и центра при­ близительно совпадают. В результате относительная адсорбция различных изомеров меняется чаще, чем удерживание в жидкожидкостных системах. В жидких фазах (растворах) молекулы растворителя могут занять оптимальное для взаимодействия с мо­ лекулами образца положение, поэтому ТЖХ обычно проявляет большую селективность при разделении изомеров, чем другие ме­ тоды ж х .

Таблица 6.2

Разделение изомеров методом ТЖХ (адсорбент—окись алюминия)3 [6—8]

В табл. 6.2 приведены примеры некоторых типов разделений, легко осуществляемых методом ТЖХ. Часто небольшие разли­ чия в структуре приводят к большим различиям в величинах а. Например, на окиси алюминия значение k' для соединения I мо-

В ТЖХ требуемую селективность можно обычно достигнуть,

тодикой, легче изучать селективность различных систем раство­ рителя. Возможности изменения селективности при использовании различных систем растворителей в ТЖХ также большие из-за предпочтительного концентрирования полярного компонента рас­ творителя (из смеси растворителей) в адсорбированный монослой. Это означает, что неподвижные фазы (т. е. адсорбированный рас­ творитель плюс адсорбент), а соответственно и селективность мо­ гут быть самыми разными.

О селективности ТЖХ подробно говорится в работе [5].

В.Некоторые вопросы методики ТЖХ

/.Подбор колонок

Чтобы получить требуемое разделение, прежде всего нужно правильно выбрать колонку. Мы должны определить тип адсор­ бента (силикагель, окись алюминия и т. д.); размер его частиц, площадь поверхности и геометрию (сферические или нерегуляр­ ные, пористые, поверхностно-пористые или пленочные и т. д.); со­ держание воды в адсорбенте; размер колонки и способ ее запол­ нения. Далее мы коротко рассмотрим все эти факторы, а более подробно они обсуждаются в работах [1] и [5].

Обычно об адсорбенте мы не беспокоимся. Силикагель — хо­ роший адсорбент, пригодный для использования в самых раз­ личных целях, выпускается промышленностью. Кроме того, сили­

может потребоваться, только если необходимо изменить селек­ тивность разделения, а замена растворителя не может обеспечить