5. ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

5.1 Методы ультрацентрифугирования

Одним из самых распространенных методов изучения природных и синтетических полимеров является метод ультрацентрифугирования. Он заключается в создании больших центробежных ускорений, превышающих ускорение земного притяжения в 104-105 раз в роторах, вращающихся со скоростями до 60000 об/мин. Под действием таких сильных центробежных полей происходит осаждение (седиментация) молекул растворенного полимера, аналогично осаждению крупных частиц суспензии под действием поля тяготения Земли. При низких ускорениях осаждение частиц молекулярных размеров невозможно вследствие броуновского теплового движения, влияние которого тем больше, чем меньше размер частиц;

В случае, когда скорость диффузии за счет теплового движения частиц значительно меньше скорости осаждения под действием центробежного поля, можно непосредственно измерять скорость седиментации частиц. При этом в растворе, первоначально гомогенном, вследствие осаждения частиц образуются две области: область чистого растворителя и область раствора, содержащего исследуемые частицы (для биополимеров растворителями обычно служат солевые и буферные водные растворы). Между этими областями имеется переходная зона (граница), в которой концентрация полимера плавно изменяется от нуля до некоторого максимального значения. Наблюдение скорости перемещения этой границы лежит в основе метода скорости седиментации. В реально наблюдаемой переходной зоне концентрация никогда не изменяется резко и зона имеет конечную ширину. Она размывается, вопервых, вследствие диффузии осаждаемых частиц, во-вторых, за счет полидисперсности препаратов по молекулярному весу в результате осаждения разных частиц с разными скоростями. В этом случае по величине размытия границы возможна оценка степени полидисперсности исследуемого образца. Важной разновидностью метода скорости седиментации является метод осаждения в градиенте плотности.

При относительно небольших центробежных ускорениях поток седиментирующего вещества оказывается сравнимым по величине с потоком вещества в противоположную сторону, вызванным диффузией, так что граница между раствором и растворителем не образуется, а происходит лишь некоторое перераспределение концентрации в кювете. Очевидно, концентрация исследуемого вещества в верхней, обращенной к оси вращения части кюветы меньше, чем концентрация в исходном растворе. Ближе ко дну кюветы концентрация, наоборот, возрастает, превышая исходную. При достаточно длительном времени центрифугирования устанавливается равновесие потоков вещества в каждой точке и образуется равновесное распределение вещества по длине кюветы. По форме установившегося распределения можно судить о свойствах исследуемых частиц, в частности об их молекулярном весе.

Те же самые сведения, но с несколько меньшей точностью, можно получить, анализируя распределение концентрации в кювете в начальной стадии установления равновесия. Этот метод, называемый методом приближения к равновесию (метод Арчибальда), широко применяется в практике. К методу седиментационного равновесия можно также отнести метод равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности. При длительном ультрацентрифугировании концентрированных растворов низкомолекулярных солей (таких, как CsCl, Cs2SO4 ацетат цезия, RbBr, KBr и др.) возникает градиент плотности за счет перераспределения концентрации солевого раствора. Макромолекулы, находящиеся в таком растворе, через некоторое время располагаются в узкой зоне, где локальная плотность растворителя соответствует плотности этих макромолекул. Этот метод позволяет проводить фракционирование макромолекул по их плотности, оценить гетерогенность изучаемого образца по плотности, а также его молекулярный вес. Это перечисление хорошо демонстрирует гибкость метода ультрацентрифугирования и его возможности в исследовании макромолекул.

Центробежные ускорения, создаваемые в ультрацентрифугах, достигают 300000 g . В процессе работы температура ротора поддерживается постоянной и

измеряется при помощи термопары, расположенной в вакуумной камере вблизи ротора. Ротор вращается в камере с глубоким вакуумом (10-3-10-4 мм рт. ст.) во избежание нагрева ротора. Рабочий диапазон температур в ультрацентрифугах обычно составляет 0–35°, а при наличии специальной приставки – 120°. Температура поддерживается с точностью ~0,1° и измеряется с точностью ~0,02°. Ультрацентрифуги снабжаются разнообразными роторами, отличающимися размерами, количеством и емкостью пробирок. Аналитический ротор имеет обычно два отверстия-гнезда для аналитической кювёты и ее противовеса диаметром ~2,5см. Расстояние от оси вращения до центра кюветы, как правило, равно 6.5см.

5.2 Метод скорости седиментации

Метод скорости седиментации и его разновидности широко применяются как для исследования свойств макромолекул в растворе, так и для разделения веществ. Основной измеряемой величиной в этом методе является коэффициент седиментации, который зависит от формы макромолекулы в данном растворе и от молекулярного веса.

Движение макромолекулы в центробежном поле происходит поддействием равнодействующей центробежной силы VρMω2 x и выталкивающей силы

Архимеда VρPω2 x . Здесь V - объем молекулы, ρM и ρP - плотность молекулы

и плотность растворителя, ω - угловая скорость вращения ротора и x - расстояние до оси вращения. Таким образом, результирующая этих двух сил

равна V (ρM − ρP )ω2 x . В расчете на один 1 моль эта сила равна NAV (ρM − ρP )ω2 x , где NA - число Авогадро. Заметим, что в центробежном поле частицы могут не только осаждаться, но и двигаться против поля, если

плотность растворителя больше плотности молекулы.

Равнодействующая центробежной силы и силы Архимеда уравновешивается силой вязкого трения:

где V = ρM −1 - удельный парциальный объем молекулы, равный обратной величине плотности молекулы и f - молярный коэффициент трения. Это уравнение можно записать, используя молекулярный вес M :

Для разбавленных растворов коэффициент трения f выражают через коэффициент диффузии D при помощи соотношением Эйнштейна: f = RTD ,

где R - газовая постоянная и T - температура. Подставляя эту формулу в уравнение (5.2), получаем первую формулу Сведберга для определения молекулярного веса макромолекул:

где s = dxdt ω12 x - коэффициент седиментации. При выводе этой формулы не

делалось никаких предположений о форме молекулы, поэтому такой метод определения молекулярного веса является абсолютным наряду, например, с методами светорассеяния. В неявном виде зависимость коэффициента седиментации от формы входит в коэффициент трения f или коэффициент

диффузии D . Коэффициент диффузии D определяется независимым способом; при некоторых условиях, однако, его можно определить и из седиментационного эксперимента.

Коэффициент седиментации, как следует из его определения, представляет собой отношение скорости седиментирующей границы к центробежному ускорению. Эту величину, имеющую размерность [с], можно записать в виде

где xм - расстояние мениска раствора от оси вращения, показанная на рис.5.1.

Единицей коэффициента седиментации является 1 Сведберг = 10-13с. При измерении коэффициента седиментации фиксируется положение седиментационной границы в определенные моменты времени. Так как граница седиментирующего вещества имеет конечную ширину, в качестве границы должна приниматься точка, концентрация в которой составляет половину

Рис.5.1 Схема, объясняющая эффект радиального разбавления

величины концентрации на плато. Концентрация раствора ct в области плато со

временем уменьшается. Этот эффект, носящий название радиального разбавления, связан с секториальной формой ячейки и линейным увеличением центробежного поля с расстоянием.

Рассмотрим в момент времени t малый элемент объема dV1 = hϕxdx , где

h - постоянная толщина кюветы в направлении, перпендикулярном плоскости чертежа. В следующий момент t + dt молекулы займут другой объем – dV2 ,

который по сравнению с начальным несколько увеличивается в радиальном направлении за счет увеличения скорости молекул вследствие неоднородности центробежного поля (см. (5.2)). Из-за секторной формы ячейки увеличивается и поперечный размер объема, занимаемого молекулами полимера, общее число которых в слое, естественно, не изменяется. Если, например, в начальный момент времени положение седиментационной границы совпадает с мениском, то при этих условиях в соответствии с (5.5) имеем

x = xмeω2st , x + dx = (xм + dxм )eω2st

где dxм - толщина слоя при t = 0 . В результате концентрация молекул

полимера в момент времени t в области плато связана с начальной концентрацией c0 соотношением

Граница седиментации определяется положением слоя с концентрацией cгр = ct 2.

Для экспериментального определения коэффициента седиментации строится график зависимости ln(xxм ) от времени и находится как

отношение тангенса угла наклона этой кривой к ω2 . Отступления от линейности наблюдаются в двух случаях: при сильной зависимости коэффициента седиментации от концентрации и тогда, когда растворитель ведет себя как сжимаемая жидкость. Первое выражается в увеличении коэффициента седиментации со временем, так как в силу секторного разбавления раствора концентрация, а следовательно, вязкость и коэффициент трения f уменьшаются. Во втором случае эффект носит противоположный характер ввиду того, что со временем граница продвигается в область все большей плотности и все большей вязкости

растворителя. В обоих случаях для вычисления коэффициента седиментации необходимо применять специальные экстраполяционные поправки для приведения ln(xxм ) к нулевому моменту времени. При малых концентрациях

применения особых методов экстраполяции не требуется.

При измерении молекулярного веса необходимо, чтобы все величины, входящие в выражение (5.4), были измерены при одной и той же температуре. Если коэффициент седиментации измерен при некоторой температуре, отличной от температуры, при которойопределен, например, коэффициент диффузии, то он может быть приведен к этой температуре. Кроме того, так как коэффициент седиментации является характеристикой индивидуального вещества, необходимо приведение этой величины к некоторым стандартным условиям с определенными температурой, плотностью и вязкостью растворителя. В качестве стандартных условий принимается температура 20°, а плотность и вязкость растворителя – соответствующие этой температуре. Как видно из уравнения (5.2), коэффициент седиментации обратно пропорционален молярному коэффициенту трения, который Коэффициент трения пропорционален вязкости растворителя, которая в свою очередь обратно пропорциональна температуре растворителя. Таким образом, приведение к заданной температуре производится умножением измеренной величины на st на отношение вязкостей ηt η0 , где индекс t

относится к условиям экспермента, а 0 – к заданным условиям.

Сдругой стороны, коэффициент седиментации, коэффициент

седиментации пропорционален (1−V ρP ). Следовательно, увеличением

температуры s увеличивается, так как уменьшается плотность среды. Увеличение коэффициента седиментации за счет плотности до некоторой

степени компенсируется изменением удельного парциального объема V , который увеличивается с температурой для большинства полимеров на 5·10- 4см3/г·град. В результате суммарная поправка вводится множителем

Значения вязкости и плотности могут быть либо взяты из таблиц, либо определяются опытным путем. Парциальный объем при заданной температуре определяется экспериментально, а переход к стандартным условиям производится с учетом приведенного выше коэффициента. Основной вклад в выражение (21) вносит сомножитель, связанный с вязкостями, второй сомножитель в большинстве случаев значительно меньше и часто может быть заменен единицей. При работе с водными буферными системами коэффициент седиментации приводят к 20° и к вязкости воды аналогичным способом:

s20,w = st ηt 1−V20 ρ20 .

η0 1−Vt ρt

Вследствие гидродинамического взаимодействия макромолекул коэффициент седиментации зависит от концентрации седиментирующего материала. Эта зависимость для различных веществ выражена в различной

мере, и, следовательно, величина s , измеренная при какой-то одной концентрации, не может служить однозначной характеристикой размеров и формы макромолекул. Для исключения взаимодействия макромолекул коэффициент седиментации экстраполируют к бесконечному разбавлению. Полученное таким образом значение называется константой седиментации s0 , которая характеризует индивидуальную молекулу.

Часто пользуются так называемой характеристической константой седиментации

Так как величина f пропорциональна вязкости, то константа [s] от вязкости

не зависит. Характеристическая константа седиментации зависит только от формы и размеров частицы и является величиной, удобной для исследования влияния внешних условии на конформацию молекулы.

Коэффициент диффузии содержит в неявном виде информацию о форме молекул исследуемого вещества. Уже само по себе изучение диффузии в комбинации с другими гидродинамическими данными является методом исследования размеров и формы частиц. Явление диффузии заключается в переходе растворенного вещества из области с высокой концентрацией в область с более низкой концентрацией. При этом согласно первому закону Фика количество вещества, прошедшего за единицу времени через площадку единичного сечения, перпендикулярную к направлению распространения вещества, пропорционально градиенту концентрации в этом направлении. Коэффициент пропорциональности носит название коэффициента диффузии:

где I - поток вещества за единицу времени через площадку единичной площади. В соответствии с этим равенством размерность коэффициента диффузии – это см2/с. Отрицательный знак в выражении (23) указывает на то, что диффузия идет в сторону уменьшающейся концентрации. Пользуясь первым законом Фика, можно определить величину коэффициента диффузии, однако чаще определения D используют уравнение диффузии:

∂∂ct = ∂∂ (D ∂∂ct ) .

Измерение коэффициента диффузии производится на специальных приборах по скорости размывания искусственно созданной резкой границы между раствором исследуемого вещества и чистым растворителем. Возможно также определение коэффициента диффузии и из ширины границы седиментации. При этом в любом случае требуется высокая степень гомогенности исследуемого вещества.

Если коэффициент диффузии необходимо привести к стандартным условиям, то, учитывая выражение связь между f и D и соотношение

(5.6), получаем выражение для приведенного коэффициента диффузии

D = Dt ηt T0 .

η0 T

Для измерения молекулярных весов необходимо определение величины (1−V ρP ). Значение парциально удельного объема для белков лежит между

0,70-0,75мл/г, а плотность растворителя (водный буферный раствор) близка к единице. Таким образом, точность определения молекулярного веса в значительной мере зависит от точности определения парциального удельного

объема. Стандартный пикнометрический метод определения V (взвешиванне фиксированных объемов растворителя и раствора) заключается в измерении плотности растворителя ρP и плотности раствора ρ с концентрацией

растворенного вещества c . Удельный парциальный объем равен

V = 1 − 1 ρ − ρP .

ρP c ρP

Для некоторых веществ выражение (5.4) не может быть использовано ввиду невозможности определения коэффициента диффузии (вещество нестабильно и разлагается за время диффузионного опыта или имеет очень малый коэффициент диффузии). К таким вещества относятся нуклеиновые кислоты. В этом случае молекулярный вес можно определить по формуле Минделькерна-Флори:

MW = s0 [η]1 3η0 NA 3 2 .

β(1 −V ρP )

где [η]- характеристическая вязкость, MW - средневесовой молекулярный вес, β - параметр, определяющий степень доступности объема, занятого

макромолекулой, для молекул растворителя.

Применение этой формулы требует определения трех основных величин: характеристической диетической вязкости, константы седиментации s0 и параметра β , который может также зависеть от молекулярного веса. Для

большого класса линейных цепных макромолекул параметр β постоянен в

широком диапазоне молекулярных весов и в среднем близок к величине 2,5·106. В настоящее время накоплен большой материал для установления зависимости характеристической вязкости и константы седиментации от молекулярного веса ДНК различного происхождения. Молекулярный вес ДНК определялся либо методом светорассеяния (до M =3·106), либо ауторадиографически при помощи электронного микроскопа.

6.ОСНОВЫ РЕОЛОГИИ

6.1Физические основы реология

Физической основой для моделирования вязкоупругих свойств

Проведенное рассмотрение соответствует модели Кельвина-Фойгта, в которой упругий и вязкий элементы соединены параллельно (напряжения складываются), как показано на рис.3б. В этой модели деформация экспоненциально возрастает со временем, а при снятии нагрузки в некоторый момент времени (σxx = 0 при t ≥ t1 ) экспоненциально убывает. В реальных

полимерах вязкоупругая деформация действительно происходит сразу же после приложения нагрузки. Поэтому модель Кельвина-Фойгта, вытекающая непосредственно из соотношений (6.2)-(6.3), достаточно реалистична. Она позволяет, например, продемонстрировать собственно фазу ползучести вязкой

причем скорость его изменения лимитируется только вязкостью ткани. При выполнении обратного неравенства величина относительного удлинения определяется только модулем Юнга ткани.

В принципе в композитных полимерных материалах, к которым относятся мягкие ткани, могут реализоваться разные виды деформаций: упругая, вязкоупругая и вязкая. Сочетание этих трех элементов позволяет создавать модели, наиболее полно отражающие механические свойства тел и, в частности, биологических объектов. При этом их вязкоупругие свойства моделируются системами, состоящими из различных комбинаций двух простых моделей: «пружина» и «поршень». Наиболее простой системой, сочетающей упругие и вязкие свойства, является модель Максвелла, в которой последовательно соединены упругий и вязкий элемент (рис.6.1а).

При воздействии постоянной силой пружина мгновенно упруго удлиняется до значения, определяемого законом Гука, а поршень движется с постоянной скоростью до тех пор, пока действует постоянное напряжение. Так реализуется ползучесть в этой модели. Если быстро растянуть модель Максвелла и сохранять затем постоянное удлинение, то пружина после быстрого растяжения начнет сокращаться, вытягивая поршень. Со временем будет происходить релаксация, т.е. уменьшение напряжения. Физически в модели Максвелла следует суммировать не напряжения, а относительные удлинения последовательно соединенных элементов

Из уравнения (6.5) легко убедиться, что при постоянном напряжении скорость изменения относительного удлинения снова описывается формулой (6.4). Если же поддерживается постоянное удлинение, то напряжение релаксирует по экспоненциальному закону по мере того, как сокращается растянутая пружина и вытягивается поршень: