диссертации / 64

61

состояниях возможен при оценке мазка периферической крови. Результаты визуального подсчета нормобластов сопоставимы по точности с подсчетом на гематологическом анализаторе [С.М. Льюис и соавт., 2009; A. Stachon et al, 2008; H. Boskabadi et al, 2010; R.D. Christensen et al, 2011].

Реактивация синтеза HbF в постнатальный период имеет место в результате стрессового эритропоэза, определение уровня фетального гемоглобина в динамике позволяет судить о состоянии системы эритрона [В.Г. Шамратова В.Г. и

соавт., 2010; Ю.А. Кривенцев и соавт., 2011; M. Gabbianelli, U. Testa, 2009].

Спектрофотометрический анализ популяций эритроцитов был предложен отечественными учеными И.И. Гительзоном и И.А. Терсковым более 50 лет назад.

Кислотная устойчивость эритроцитов имеет тесную связь с возрастом эритроцитов и их функциональным состоянием. В физиологических условиях соотношение эритроцитов, различных по стойкости, строго стабильно и отражает динамическое равновесие в системе крови, обеспечивающее соответствие между деятельностью процессами эритропоэза и эритродиереза. При воздействии на мембрану эритроцитов различных повреждающих факторов, напряженном эритропоэзе соотношение между эритроцитами разной стойкости, существующее в нормальных условиях, изменяется. Изучение кислотной устойчивости эритроцитов не потеряло своей актуальности до настоящего времени [И.И.

Гительзон, И.А. Терсков, 1959; И.Г. Длусская и соавт., 1991; И.И. Сахарчук и соавт., 1991; Н.Р. Сахау и соавт., 2005; А.А. Михайлис, 2009; Л.В. Алачева и соавт., 2010; Н.К. Кочарли и соавт., 2012].

Следует отметить, что отечественными учеными уделяется недостаточно внимания оценке важных параметров системы эритрона, у новорожденных в целом, и в частности, у новорожденных с синдромом полиорганной недостаточности. В отечественной литературе имеются лишь единичные работы,

описывающие у доношенных и недоношенных новорожденных те или иные характеристики эритрона в динамике, полученные с помощью гематологического анализатора [Пясецкая, 1999; Р.А. Жетишев и соавт., 2008; Г.Е. Стоцкая и соавт.,

62

2010; Н.А. Маянский и соавт., 2012]. Работ, использующих параметры системы эритрона в качестве маркеров, позволяющих уточнить прогноз и оптимизировать методы лечения СПОН у новорожденных в отечественной и зарубежной литературе, нами не обнаружено.

63

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Характеристика обследованных новорожденных

Исследование проведено на базе Челябинской областной детской клинической больницы (ЧОДКБ), отделений реанимации и интенсивной терапии

(ОРиИТ) №1 и №2, педиатрического отделения для новорожденных детей. В

исследование включено 453 новорожденных ребенка, поступивших с января 2009 года по май 2011 года в раннем неонатальном периоде в отделения реанимации и интенсивной терапии ЧОДКБ. Недостаточность двух и более систем органов на момент поступления в отделение реанимации являлась критерием для включения в исследование. Критериями исключения из исследования были наличие у новорожденного хромосомных аномалий, пребывание новорожденного в ЧОДКБ менее 48 часов. Среди включенных в исследование новорожденных мальчиков было 269 (59,4 %), девочек 184 (40,6%). Недоношенными (родившимися до окончания 37 недели гестации) были 297 (65,6%) новорожденных. Среди включенных в исследование новорожденных малую массу при рождении имели 281 (62%) детей, в том числе низкую массу тела при рождении имели (НМТ) 189 (41,7%) детей, очень низкую массу тела (ОНМТ) при рождении имели 67 (14,8%) детей, экстремально низкую массу тела (ЭНМТ) при рождении имели 25 (5,5%) детей. Таким образом, среди обследованных новорожденных преобладали недоношенные дети с малой массой тела при рождении, мальчиков было больше, чем девочек. Все включенные в исследование новорожденные поступили в отделения реанимации ЧОДКБ из городских и районных родильных домов Челябинской области. Госпитализация осуществлялась с использованием специализированного транспорта в условиях термоадаптации и проведения посиндромной терапии. Длительность транспортировки зависела от удаленности родильного дома от ЧОДКБ. Минимальное время транспортировки 30 мин,

64

максимальное 7 часов.

В исследовании представлены результаты наблюдения за новорожденными с момента поступления в отделения реанимации и интенсивной терапии до исчезновения органных дисфункций, либо до наступления летального исхода

(ЛИ). Новорожденные, у которых исчезновение органных дисфункций имело место в неонатальном периоде, находились под нашим наблюдением до окончания неонатального периода.

На всех включенных в исследование новорожденных заполнялась регистрационная карта, включающая анамнестические и клинические данные,

результаты лабораторного и инструментального обследования, особенности проведенного лечения. Для оценки тяжести СПОН все включенные в исследование новорожденные ежедневно за весь период наблюдения оценивались по шкале NEOMOD, предложенной для оценки тяжести СПОН у новорожденных

J. Janota et al (2008), (табл. 1).

Таблица 1

Шкала NEOMOD (J. Janota at al., 2008)

65

Примечание: ВЖК — внутрижелудочковое кровозлияние, ПВЛ — перивентрикулярная лейкомаляция, СДППД — система дыхания под постоянным положительным давлением, ИВЛ

— искусственная вентиляция легких, SaO2 - % насыщения гемоглобина артериальной крови кислородом, ЯНЭК — язвенно-некротический энтероколит, АД — артериальное давление.

Новорожденные (n=175) с максимальной оценкой по шкале NEOMOD в

раннем неонатальном периоде 4 и менее баллов (умеренные проявления СПОН) составили группу №1. Новорожденные (n=197) с максимальной оценкой в раннем неонатальном периоде 5 и более баллов (тяжелые проявления СПОН) составили группу №2. Новорожденные с ЛИ за период наблюдения (n=81) составили группу №3. Среди новорожденных группы №3 максимальную оценку по шкале NEOMOD

в раннем неонатальном периоде менее 5 баллов имели 4 (4,9%) новорожденных, то есть у 95% новорожденных с ЛИ в раннем неонатальном периоде имели место тяжелые проявления СПОН. При изучении влияния различных факторов на исход СПОН, включенных в исследование новорожденных групп №1 и №2 (выжившие новорожденные) объединяли и сравнивали с группой №3 (умершие новорожденные), при изучении влияния различных факторов на тяжесть СПОН вне зависимости от исхода, включенных в исследование новорожденных групп №2 и №3 (тяжелые проявления СПОН) объединяли и проводили сравнение с группой №1 (умеренные проявления СПОН). При оценке параметров системы эритрона в зависимости от тяжести СПОН и исхода учитывали соспоставимость новорожденных в группах по гестационному возрасту.

66

2.2 Условия пребывания, лабораторные и инструментальные методы

исследования, лечебные мероприятия

Все поступившие в отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденные находились в стандартных условиях — новорожденные с весом менее 2 кг находились в кувезах «Caleo» (Draеger, Германия), новорожденные с весом более 2 кг находились в условиях реанимационных неонатальных столов

«Babytherm 8010» (Draеger, Германия). Всем новорожденным осуществлялся мониторинг температуры тела, артериального давления, частоты сердечных сокращений, насыщения гемоглобина артериальной крови кислородом с использованием прикроватного монитора «IntelliVue MP5» (Philips, Нидерланды).

Респираторная поддержка осуществлялась с использованием аппаратов искусственной вентиляции легких «Avea» (Viasys, США).

В план обследования новорожденных входили методы клинического,

лабораторного и инструментального обследования, осмотр окулиста, невролога,

по показаниям — хирурга.

Лабораторные методы включали следующие исследования. Определение количества гемоглобина, эритроцитов, уровня гематокрита, лейкоцитов с лейкоцитарной формулой, тромбоцитов проводили с использованием гематологического анализатора «Аbacus DIATRON» (Австрия). Уровень мочевины, креатинина, глюкозы, общего билирубина и фракций билирубина,

аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), общего белка и белковых фракций (альбумина и глобулинов), лактата, С-реактивного белка,

концентрации калия, натрия, кальция определяли с использованием биохимического анализатора «RX daytona» (Randox, Великобритания). При наличии показаний оценивали уровень прокальцитонина с использованием тестовой системы «BRAHMS РСТ-Q» (BRAHMS, Германия). Анализ газового состава и кислотно-основного состояния крови проводили с использованием гематологического анализатора «ABL 800 FLEX» (Radiometer, Дания). Общий

67

анализ мочи и кала выполняли по общепринятым методикам.

Микробиологический мониторинг — бактериологические посевы с определением чувствительности к антибиотикам с кожи, слизистых оболочек, пупочной ранки,

трахеобронхиального дерева, по показаниям — бактериологические посевы ликвора и крови осуществлялись с использованием бактериологического анализатора «Bactec 9050» (Becton Dickinson, США). По показаниям проводили исследования крови, мочи, ликвора методом ДНК-зондовой гибридизации на наличие цитомегаловирусной, герпетической, хламидийной, уреаплазменной инфекции с использованием амплификатора «Swift MaxPro» (ESCO, Юго-

Восточная Азия).

Для оценки интенсивности оксидативного стресса у новорожденных показатели перекисного окисления липидов в плазме (уровень диеновых конъюгатов, кетодиенов, сопряженных триенов) определяли по методу И.А.

Волчегорского (1989) [И.А. Волчегорский и соавт., 1989] с использованием фотоэлектрокалориметра AP-101 (Япония).

Инструментальные методы исследования включали нейросонографию,

ультразвуковое исследование органов брюшной полости и забрюшинного пространства, по показаниям — эхокардиографию, ультразвуковое исследование спинного мозга, органов грудной полости и суставов с использованием ультразвукового сканера «MyLab 20» (Esaote, Италия). Рентгенологическое исследование органов грудной клетки, по показаниям — брюшной полости (в том числе с контрастированием), шейного отдела позвоночника, черепа, суставов проводилось с использованием рентгеновской установки «MobileArt MUX-100H» (Shimadzu, Япония).

Всем новорожденным, включенным в исследование, проводилась терапия,

включающая в себя по показаниям оксигенотерапию, респираторную поддержку,

инотропную поддержку; инфузионную терапию с учетом физиологической потребности и патологических потерь, потребности в электролитах;

парентеральное питание с учетом потребности в калориях, белках, жирах,

углеводах, энтеральное питание с учетом толерантности желудочно-кишечного

68

тракта; антибактериальную терапию; по показаниям — переливание свежезамороженной плазмы, эритроцитарной массы, тромбоцитарной массы,

иммуноглобулина, альбумина, противовоспалительная терапия. При наличии показаний новорожденным проводилось хирургическое лечение. Манипуляций, не указанных в подписанном родителями информированном согласии, включенным в исследование новорожденным не проводилось.

2.3 Методы исследования состояния системы эритрона

Для изучения состояния системы эритрона у новорожденных с СПОН приоритет был отдан методам, являющимся информативными и при этом не требующим больших объемов крови. Определение количества эритроцитов,

гемоглобина, уровень гематокрита, среднего объема эритроцитов (MCV, mean cell volume), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (MCH, mean cell hemoglobin), средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (MCHC, mean cell hemoglobin concentration), показателя разброса эритроцитов по объему (RDW, red cell distribution width) проводилось на гематологическом анализаторе «Аbacus DIATRON» (Австрия). Количество HbF определяли с использованием гемоксиметра «ABL 800 Flex» (Radiometer, Дания).

Исследование морфологии эритроцитов проводили с использованием световой иммерсионной микроскопии. Оценивали форму эритроцитов в окрашенных по Романовсому-Гимза мазках периферической крови. Количество эритроцитов дискоидной формы и эритроцитов с измененной формой выражали в процентах, расчет производился на основе анализа 200 эритроцитов. Выделяли следующие разновидности формы эритроцитов — эхиноциты, сфероциты,

эллиптоциты, стоматоциты, кодоциты, дегмациты, дакриоциты, шизоциты

(фрагментированные эритроциты). Серповидные эритроциты, пузырчатые эритроциты, пойкилоциты, акантоциты были объединены в рубрику «другие

69

формы эритроцитов», так как частота встречаемости каждой формы в обследованной группе новорожденных не превышала 1% [С. М. Льюис и соавт.,

2009]. Индекс трансформации (ИТ) эритроцитов рассчитывали как отношение количества эритроцитов с измененной формой к количеству дискоцитов [В.А.

Лисовский и соавт., 1986].

Атомно-силовая микроскопия эритроцитов проведена на атомно-силовом микроскопе «SOLVER-PRO» (NT-MDT, Россия). С использованием атомно-

силовой микроскопии было получено трехмерное изображение эритроцитов и рассчитан коэффициент сферичности (K) эритроцитов, являющийся параметром,

который количественно характеризует интегральную способность эритроцитов к выполнению ими газотранспортной функции. Коэффициент К рассчитывали как отношение толщины эритроцита в центре к толщине эритроцита на половине радиуса. Этот параметр пропорционален отношению площади поверхности эритроцита к его объему и изменяется в диапазоне от 0,1 до 1,155. Увеличение K

свидетельствует о приобретении эритроцитами сферической формы, что приводит к нарушению функциональной активности эритроцитов [Теория и практика микроскопии эритроцита. В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Е.А. Степовая и соавт.,

2008]. Коэффициент K определяли как среднее значение коэффициентов сферичности отдельных эритроцитов, фиксированных на стекле. Получено среднее значение K для 30 эритроцитов в каждом образце.

Кислотную устойчивость эритроцитов определяли методом, предложенным И.И. Гительзоном, И.А. Терсковым (1959) [И.И. Гительзон, И.А. Терсков, 1959] с

использованием фотоэлектрокалориметра AP-101 (Япония). Сущность методики представлена ниже. Термостат заливали дистиллированной водой, устанавливли Т

24°С. Фотоэлектрокалориметр включали в сеть, прогревали 20 минут. 10 мкл крови помещали в пробирку с 1,0 мл физиологического раствора, маркировали и помещали в термостат. В термостат помещали также маркированные пробирки с

0,004 N соляной кислотой и физиологическим раствором. На фотоэлектрокалориметре устанавливали красный светофильтр (620 нм), за 0

принимали плотность физиологического раствора. Плотность эритроцитарной

70

взвеси в физиологическом растворе приводили к стандартной: эритроцитарную взвесь помещали в рабочую кювету и добавляли необходимое количество физиологического раствора, пока плотность взвеси эритроцитов не станет равна

0,700. В рабочую кювету помещали 500 мкл эритроцитарной взвеси в стандартной концентрации и 500 мкл 0,004 N соляной кислоты, содержимое кюветы перемешивали стеклянной палочкой, одновременно включали секундомер,

каждые 30 секунд регистрировали оптическую плотность взвеси эритроцитов с соляной кислотой. В результате получался убывающий ряд значений оптической плотности, соответствующий распределению эритроцитов по стойкости. Отсчеты проводили до тех пор, пока не было получено 3 совпадающих показания, что служило признаком конца гемолиза. Остаточное показание составляло, как правило, 0,040 – 0,060, что объясняется поглощением гематина, образовавшегося под действием соляной кислоты. Разность между измерениями оптической плотности соответствовала числу эритроцитов, распавшихся за время, прошедшее между двумя измерениями. За 100 % принималась разность между первым и последним отсчетом. Количество эритроцитов, распавшихся каждые 30 секунд,

рассчитывали как отношение разницы между последующим и предыдущим отсчетом к разнице между первым и последним отсчетом. По результатам отсчета возможно построение графика – эритрограммы, и представление данных в виде следующих численных значений. Общее время гемолиза (ОВГ) – время в минутах от начала отсчета до завершения гемолиза (получения 3-х совпадающих значений). Стадия с максимальной скоростью гемолиза (СМСГ) – на какой минуте распалось максимальное количество эритроцитов. Уровень максимального гемолиза (УМГ) – количество эритроцитов (в %), распавшееся на стадии с максимальной скоростью гемолиза. Количество высокостойких эритроцитов

(ВСЭ) – количество эритроцитов, распавшихся после 10-й минуты от начала гемолиза (в %).

Подсчет нормобластов осуществляли в мазке периферической крови,

окрашенном по Романовскому-Гимза при анализе лейкоцитарной формулы,

выражая количество нормобластов по отношению к 100 лейкоцитам.