bkh_dlya_tebya
.pdf(образуются между альфа-аминогруппой и альфа-карбоксильной группой, довольно прочная связь) и дисульфидные (у цистеина убираете от серы водород и две серы соединяете вместе). Почему эти связи называют сильными? А потому, что ковалентная связь – это общая орбиталь между атомами, её не разорвать без химической реакции. Что касается слабых связей – водородные, ионные и гидрофобные. Водородные это когда полярные группировки притягиваются к воде и друг к другу (плюс к минусу), ионные связи это почти то же самое, просто образуется связь между полярными заряженными группировками (снова плюс к минусу), гидрофобные связи – всё неполярное прячется от полярного и взаимопритягивается. Почему эти связи слабые? Ну потому что полекулы не связаны между собой орбиталью, а связаны они притяжением, которое можно пересилить и без химических реакций. Как? Вспомните, что все молекулы движутся, и чем они более нагреты, тем быстрее они движутся, это называется тепловым движением. Вот движутся две молекулы, встречаются
и связывают друг друга слабой связью и держатся вместе. Но если температура высока, молекулы движутся слишком быстро и слабые связи неспособны удержать их вместе. Таким образом, если энергия теплового движения выше энергии слабой связи, то связь разрушается. А вот с ковалентной связью (сильной) так бы не получилось. Вот вам и разница.
Структура белка
Теперь от связей перейдём к структуре белков. У белков есть 4 структуры. Первичная структура представляет собой полипептидную цепь, причём не абы какую – порядок аминокислот детерминирован геном, кодирующем данный белок. Аминокислоты связаны прочной ковалентной пептидной связью, которая образуется между альфа-аминогруппой и альфакарбоксильной группами (-CO-NH-) – единственная связь, поддерживающая первичную структуру, связи знать надо. Почему так важен порядок аминокислот? Да потому что формирование дальнейших структур будет зависеть от радикалов этих аминокислот, которые будут взаимодействовать между собой, изгибая полипептидную цепь, образуя трёхмерную нативную структуру (нативная – правильная структура, при которой белок обладает полной биологической активностью). Чтобы понимать, насколько аминокислоты «решают», просто замените одну аминокислоту в молекуле гемоглобина и получите серпоклеточную анемию. Так что информационная роль первичной структуры такова, что она определяет все последующие структуры.
11
Вторичная структура образуется за счёт водородных связей между участками пептидной связи. Существуют две формы вторичной структуры: альфа-спираль (более стабильная) и бета-складчатость.
В витке обычной спирали 3,5 аминокислоты, вдоль спирали идут водородные связи, которые связывают эту спираль, на рисунке показана одна такая связь. Существует исключение – в молекуле коллагена в витке спирали 3 аминокислоты, но это особый случай. Спираль получается очень прочной. Бета-складчатость это когда несколько участков цепи (у меня они вырезанные) идут параллельно и между ними образуются водородные связи от пептидной. К слову, участки цепи в бета-складчатости могут идти параллельно и антипараллельно. Вторичную структуру поддерживают водородные связи, образующиеся между участками пептидной связи. Однако, помимо таких регулярных структур как альфа-спираль и бетаскладчатость, существуют такие нерегулярные структуры, как изгибы, петли и повороты. Как они образуются? Ну допустим, у вас подряд идут несколько аминокислот с громоздким радикалом (триптофан), они отталкиваются друг от друга. Либо же у вас подряд идут несколько аминокислот, которые притягиваются друг к другу. Либо же у вас идёт несколько пролинов (в его пептидной связи у азота нет водорода, поэтому нормальное формирование вторичной структуры нарушается, ибо нет водородной связи, ибо нет водорода). В общем все эти факторы ведут к тому, что классические спирали
и складчатости не образуются – образуются между ними изгибы, петли, повороты.
12
На фото я схематично изобразил, как образуется поворот между двумя спиралями из-за отталкивания между громоздкими радикалами аминокислот (триптофан).
Надвторичные структуры. Как я уже сказал, вторичная структура – это спираль или складчатость, которые занимают часть полипептидной цепи. Третичная структура – это глобула (у глобулярных белков, про фибрилярные не будем говорить), которая представляет собою шар, занимающий всю полипептидную цепь. А где же место надвторичной структуре? Она также занимает лишь часть полипептидной цепи, но по своей организации сложнее, чем спираль или складчатость, то есть сложнее вторичной. Всего существует 5 таких структур: альфа-спираль-поворот-альфа-спираль (1), альфа-бета-бочёнок (2), цинковый палец (3), лейциновая застёжка-молния
(4), домен.
13
С спираль-поворот-спираль всё ясно. Бочёнок – в центре складчатости, по периферии спирали. Палец – цинк притягивает к себе 4 аминокислоты, заставляя полипептидную цепь вот так изогнуться, эти пальцы вставляются в геном при его гормональной регуляции кстати. Застёжка молния посложнее:
в одном витке спирали 3,5 аминокислоты, каждая седьмая аминокислота – лейцин, то есть он встречается через каждые два витка, получается, если провести линию вдоль спирали, то мы увидим: лейцин, пусто, лейцин, пусто. То же и на второй спирали, получается две спирали как бы комплиментарны друг другу, к тому же лейцин неполярный, поэтому притягивается к лейцину, таким образом, получается что-то вроде молнии от куртки. Домен – это типа глобула, но не на протяжение всей полипептидной цепи, а только на её части, то есть домен формируется самостоятельно, независимо, и всегда выполняет особую функцию, например, в ферментах бывают структурные, регуляторные и каталитические домены. Надвторичные структуры поддерживаются всеми слабыми связями – водородными, ионными и гидрофобными.
Третичная структура. Глобула – шарообразная, формируется из всей полипептидной цепи, для мономерных белков является высшей структурной организацией. Образуется также слабыми связями, иногда и дисульфидными ковалентными, т.е. сильными (это чаще для секреторных белков для их устойчивости). На поверхности глобулы расположены полярные аминокислоты, так как эта часть обращена к воде, а внутри глобулы формируется гидрофобное ядро, где нет воды и спрятаны сплошные неполярные радикалы. Одной из очень важных черт глобул является наличие
14
на их поверхности кластеров – совокупность определённых, чаще гидрофобных, хотя могут быть и гидрофильные с определённым зарядом, аминокислот с определённым рельефом. Для чего они нужны? Для присоединения лиганда. Кто может выступать лигандом? Белок, углевод, липид, ион металла, гем, нуклеиновые кислоты. За счёт специфичного рельефа и заряда кластера или его гидрофобности к нему могут присоединяться только конкретные лиганды – такая специфичность. В качестве лигандов можно использовать препараты, которые будут влиять на активность белка, с которым они свяжутся. У фибрилярных белков третичная структура – что-то вроде пластины или цилиндра, нерастворимы в воде.
Четвертичная структура – ею обладают только олигомерные белки, она представляет из себя комплекс глобул, чаще чётное количество глобул. Четвертичная структура поддерживается слабыми связями. И как раз здесь играют важную роль кластеры – на каждой глобуле есть кластер из радикалов гидрофобных аминокислот, так называемое липкое пятно, через которые протомеры/глобулы соединяются друг с другом. У белков с четвертичной структурой есть особенное свойство – кооперация. Кооперация
– способность одного протомера изменять сродство к лиганду при присоединении к другому протомеру другого лиганда. Надо сказать, что конформация белка, т.е. его трёхмерная структура, лабильна, т.е. подвижна, ну ибо связи её образующие довольно слабые. Что нам это даёт? Изменение структуры белка приводит к изменению его активности. Рассмотрим на примере гемоглобина. Гемоглобин состоит из четырёх глобул, в каждой есть гем, спрятанный в гидрофобный карман, а в геме железо, и вот к этому железу прикреплён один гистидин, а второй гистидин около железа. Когда приходит кислород, он связывается с одним гистидином и с железом. Когда кислород связывается с железом и гистидином, он как бы подтягивает на себя железо, а то, в свою очередь, подтягивает, связанный с ним, второй гистидин, который вообще-то в составе полипептидной цепи, поэтому он подтягивает всю полипептидную цепь, изменяя конформацию всего протомера! А протомеры связаны, поэтому изменение конформации с одного протомера передаётся на другие. Изменение конформации приводит
кувеличению сродства к кислороду. И получается, что первую молекулу кислорода гемоглобин присоединяет неохотно, вторую в несколько раз лучше, третью гораздо лучше присоединяет, а четвёртая молекула кислорода присоединяется в триста раз легче первой. Вот вам кооперация. То есть подытожим: первая молекула/лиганд присоединилась к гемоглобину, изменилась конформация одного протомера, затем и остальных, сродство их
ккислороду (способность его присоединять) возросло, ещё одну молекулу присоедини и сродство ещё выше станет.
15
Вот график зависимости сродства кислорода от его порциального давления/напряжения.
График по идее s-образный. Какое преимущество это даёт? На определённом участке графика при небольшом изменении порциального давления/напряжения очень серьёзно изменяется сродство к кислороду, поэтому в лёгких, где порциальное давление/напряжение кислорода высоко, гемоглобин на максимум насыщается кислородом, а в тканях, наоборот, гемоглобин на максимум отдаёт кислород. Думаю, на этом про четвертичную структуру и кооперацию достаточно – большего с вас не спросят.
Есть ещё такая штука, как надмолекулярные комплексы. Это что? Это коллагеновые, эластиновые волокна, микрофиламенты и тому подобное, ещё миофибрилы. Это структуры настолько большие, что их можно рассмотреть в световой микроскоп. Главная их задача – поддержание структуры ткани, придание ей очень большой прочности, а в случае с микрофиламентами образование цитоскелета. Структура надмолекулярная, потому что размеры у неё значительно больше обычных макромолекул, состоят из белков, но это как бы понятно. Зачем такие большие? Просто чем больше размер волокон, тем выше их прочность. Ну типа для постройки дома из железо-бетона вы возьмёте металлическую сетку тонкую и густую (мелкие волокна) или нормальную арматуру (крупные волокна)? Конечно, арматура лучше, поэтому для структурных функций надмолекулярные структуры должны быть достаточно велики.
Поговорили о структуре, теперь надо и о фолдинге сказать. Что это такое? Грубо говоря, сворачивание полипептидов, приобретение ими трёхмерной структуры. Какие с этим могут быть проблемы? Ну в клетке плавает очень много веществ, которые могут прореагировать с нашим полипептидом или комплиментарно связаться с каким-то его участком, не дав ему правильно свернуться. Так как же помочь белкам правильно
16
свернуться? Специальные белки-шиппероны (да-да, от слова «шипперить») соединяются вместе, образуя изолированное пространство, в котором полипептид может нормально свернуться и приобрести нативную структуру. Помимо такой защиты, шиппероны могут катиализировать образование дисульфидных связей в белке. А есть ещё белки теплового шока. Когда сильно повышается температура и начинается денатурация многих белков, начинают синтезироваться белки теплового шока, которые прилипают к другим белкам, начавшим денатурировать и не дают им денатурировать дальше, тем самым их защищая на время перегрева. Вот такие вот шиппероны, большего о них знать и не надо.
Денатурация – утрата белком его нативной структуры в следствие воздействия определённых факторов. Обычно при денатурации полностью разрушается четвертичная, третичная и частично вторичная структуры. Обратимая денатурация – после прекращения действия денатурирующего агента белок восстанавливает нативную структуру. Необратимая денатурация
– после прекращения действия денатурирующего агента белок не восстанавливает нативную структуру, либо (!) удаление денатурирующего агента невозможно. Обратимая денатурация обеспечивается действием некоторых веществ, например, этанола в небольшом количестве, изменением кислотности среды не сильно (изменение поверхностного заряда и устойчивости, см. ниже) и повышением температуры тоже небольшим (рвутся слабые связи, пояснения были выше), если с тремя этими факторами переборщить, то денатурация может носить необратимый характер, ибо этанол может встроиться в белок неферментативно, ну образовать эфир, а при очень высокой температуре порвутся все связи в белке, например. Есть такие денатурирующие агенты, которые всегда дают необратимую денатурацию – ионы тяжёлых металлов (связываются химически с белком, изменяют его заряд и устойчивость) и некоторые вещества, встраивающиеся в белок, типа мочевины и билирубина.
Физико-химические свойства белков.
Растворимость в воде. Большинство белков (глобулярных) хорошо растворимы, хотя встречаются белки с гидрофобными доменами, которые позволяют им фиксироваться в мембранах. Фибрилярные белки (структурные) обычно нерастворимые. Растворимый белок не может выполнять свою функцию, если он перестанет быть растворимым, поэтому ему важно всегда оставаться растворимым, в этом ему помогают ионизация
и гидратация. Как я и говорил, на поверхностях глобулярных белков много радикалов полярных заряженных и незаряженных аминокислот. Чтобы белок был растворим в воде, его должен облепить слой или слои молекул
17
воды, это облегчает движение и растворимость белковой частице в воде. Образование таких оболочек называется гидратацией. Чем больше оболочки, тем выше растворимость и, соответственно, стабильность белка. Кто отвечает за формирование этих оболочек? Радикалы полярных аминокислот, так как они притягивают воду. Особая роль отводится заряженным аминокислотам, так как у них заряд полный, а не частичный, поэтому они лучше связывают воду, но ещё их можно регулировать. Как? Общий заряд на поверхности белка (ионизация) зависит от аминокислотного состава и кислотности среды. Таким образом, большинство белков способны функционировать только будучи растворёнными, для этого им необходима гидратация и ионизация. Раз уж начали говорить про ионизацию, то надо сказать и про изоэлектрическую точку (значение pH, при котором поверхностный заряд белка равен нулю). Но как влияет pH на ионизацию?
У радикалов заряженных аминокислот есть карбоксильная и аминогруппа (и немного другие). Посмотрите на первую реакцию – она обратимая, по принципу Лешителье при увеличении концентрации протонов (закисление) равновесие реакции смещается влево, отрицательный ион превращается в нейтральную молекулу, поэтому заряд становится менее отрицательным и более положительным. Смотрим на вторую реакцию – там при повышении концентрации протонов по принципу Лешителье равновесие сместится в правую сторону – из нейтральных молекул образуется положительнозаряженный ион, и опять при закислении отрицательный заряд уменьшается, а положительный растёт. При защелачении обратный эффект. Ну вот так мы показали прямую зависимость ионизации от кислотности среды, ну а зависимость от аминокислотного состава понятна – каких аминокислот больше, тот заряд при прочих равных преобладает. Что произойдёт в изоэлектрической точке? Пропадёт ионизация, ослабнет гидратация, растворимость уменьшится, белок выпадет в осадок, его активность упадёт. К слову, так регулируется активность многих ферментов, а именно путём фосфорилирования или дефосфорилирования по полярным незаряженным аминокислотным радикалам, таким образом из-за присоединения или отсоединения отрицательных фосфатов сильно меняется степень ионизации, стабильность, конформация и активность фермента. У
18
вас точно будут задачи на нахождения зоны pH, в которой лежит изоэлектрическая точка олигопептида. Как это сделать? Сложите заряды всех радикалов всех аминокислот. Например, ала-гис-лиз-асп, это 0 + + -, в итоге +1, в какую зону pH надо поместить олигопептид, чтоб довести до нуля? Ну к плюсу добавьте минус (гидрокси-ион), а минус в щелочной зоне. Если заряд пептида отрицательный, то добавьте к нему плюс (протон), а плюс – это кислая зона. Если заряд пептида равен нулю, то ничего добавлять не надо – изоэлектрическая точка в нейтральной среде.
Осаждение белков (достижением изоэлектрической точки или около того) в науке и медицине необходимо для выделения из общей массы нужных белков для исследований. Помимо этого осаждать можно путём добавления веществ, которые связываются только с конкретными белками и осаждают их.
19
Ферменты
Ферменты – это катализаторы белковой природы. Что общего у обычных катализаторов и ферментов? И те, и другие участвуют в химической реакции, ускоряя её (путём снижения энергии активации, ускоряются только термодинамически возможные реакции) и не расходуются в ней. В чём отличия? Обычные катализаторы ускоряют реакцию в несколько раз, ферменты – в сотни тысяч и миллионы! Ещё одна особенность ферментов заключается в том, что они действуют обычно в довольно мягких условиях – температура тела человека и нейтральная среда (есть исключения), а обычные катализаторы действуют в жёстких условиях, типа +400 градусов по Цельсию. И последнее, важное отличие – специфичность, каждый фермент катализирует одну или несколько близкородственные реакции (это имеет большое биологическое значение).
Строение ферментов.
Это всегда глобулярные белки, очень часто они сложные (имеют небелковую часть) и олигомерные (состоят из нескольких полипептидных цепей). Белковую часть называют апоферментом, небелковую – апоферментным кофактором (это про сложные ферменты). Что касается апофермента, на нём есть кластеры, помимо тех, что отвечают за формирование четвертичной структуры, есть регуляторные кластеры (когда к ним присоединяется соответствующий лиганд, они изменяют активность фермента), а есть ещё активный центр – это то, что делает фермент ферментом. Активный центр обычно расположен не на поверхности фермента, а в небольшом углублении – гидрофобном кармане. Активный центр представлен радикалами определённых аминокислот и часто апоферментным кофактором. В активном центре можно выделить участок связывания – радикалы аминокислот с определёнными зарядами или гидрофобные с определённым рельефом, это помогает правильно разместить и присоединить субстрат (молекулу, подвергающуюся катализу). Ещё в активном центре есть участок катализа, обычно это несколько аминокислот полярных и часто апоферментный кофактор, он отвечает за непосредственное химическое превращение. Какова роль апофермента? Он формирует основную структуру фермента, даёт ему ионизацию и гидратацию, а также отвечает за специфичность фермента. Какова роль апоферментных кофакторов и что они из себя представляют? Они необходимы для непосредственного осуществления химической реакции, окончательно формируют активный центр. Выделяют три типа апоферментных кофакторов: кофакторы (ионы металлов, типа магний, марганец), коферменты (органические соединения, способные свободно отсоединяться от апофермента и присоединяться обратно, примеры – НАД и
20