mikra

Окраска по методу Грама не используется при изучении спирохет, простейших и вирусов.

Сущность метода окраски по Граму: отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8:1 и 1:1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.

Методика окраски по методу Романовского-Гимзы:

Краска Романовского-Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура.

1.На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 м дистиллированной воды) на 10-20 мин.

2.Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

Методика окраски по методу ЦиляНильсена:

1.На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин;

2.Снять бумагу, промыть мазок водой;

3.Нанести 5% раствор серной кислоты или 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин до обесцвечивания;

4.Промыть водой;

5.Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течении 3-5 мин;

6.Промыть водой, высушить, микроскопировать.

Методика окраски по методу Ожешко:

1.На нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор хлороводородной кислоты и подогреть на пламени в течении 2-3 мин.

2.Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формысиний.

Методы, используемые для изучения нативных препаратов

Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40х.

Метод «висячей» капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют сухой объектив 8х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х и исследуют препарат.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «висячая» или «раздавленная» капля и микроскопируют. После микроскопии препараты «висячей» или «раздавленной» капли опускают в дезинфицирующий раствор.

-Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом микроскопе. Фазовоконтрастная микроскопия основана на явлении интерференции света, прошедшего и не прошедшего через объект, и позволяет наблюдать прозрачные объекты, отличающиеся от окружающей среды (или других структур клетки) по показателю преломления или по толщине и вызывающие изменение фазы прошедшего через них света. Благодаря специальному приспособлению в объективе (фазовая пластинка) и в конденсоре (кольцевая диафрагма) эти объекты выглядят более темными (позитивный фазовый контраст) или более светлыми (негативный фазовый контраст) по сравнению с окружающей средой.

-Темнопольная микроскопия (ультрамикроскопия) основана на явлении светорассеивания.

При темнопольной микроскопии в объектив попадают только лучи, рассеянные объектом, и не попадают прямые лучи от осветителя. Поэтому наблюдаемые микроорганизмы кажутся ярко светящимися на темном фоне.

Темнопольную микроскопию применяют для прижизненного изучения лептоспир, спирохет, а также микроорганизмов слишком мелких, чтобы их можно было различить при обычном светлопольном освещении. Для темнопольной микроскопии используют обычные объективы и специальные темнопольные конденсоры.

- Люминесцентная микроскопия основана на использовании явления флюоресценции. Применяют специальные люминесцентные микроскопы или приспособления к обычным микроскопам. Так как большинство микроорганизмов не обладает собственной люминесценцией, то их предварительно окрашивают (флюорохромируют) сильно разведенными растворами специальных красителей (флюорохромы), которые связываются с определенными структурами клетки.

Люминесцентную микроскопию применяют также для выявления антигенов и антител. С этой целью используют метод иммунофлюоресценции (люминесцентно-серологический метод). Этот метод позволяет выявить в препарате микробы, содержащие определенные антигены. Для их обнаружения необходимо иметь антисыворотки, содержащие антитела к этим антигенам (к антисывороткам химическим путем присоединены молекулы флюоро-хромов - люминесцирующие сыворотки). На фиксированный препарат во влажной камере наносят люминесцирующую сыворотку, инкубируют, промывают раствором хлорида натрия, высушивают и рассматривают в люминесцентном микроскопе. Если в препарате есть микробы, содержащие антиген, антитела к которому были в люминесцирующей сыворотке, они ярко светятся. Остальные микробы не люминесцируют.

- Электронная микроскопия. Изображение в электронном микроскопе образуется не с помощью световых лучей и стеклянных линз, а с помощью потока электронов, который фокусируется электрическим или магнитным полем. Разрешающая способность примерно в 2000 раз больше, чем светового (0,2 мкм), и с его помощью можно увидеть даже крупные молекулы. Применение электронного микроскопа значительно расширило знания о вирусах, фагах и других микроорганизмах.

6. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.

Рост – это увеличение бактериальной клетки в размерах без увеличения числа особей. Размножение – это увеличение числа особей в популяции, бактерия размножается бинарным поперченным делением. Скорость размножения зависит от вида бактерий, от состава питательной среды, от рН среды, температуры культивирования и аэрации. На плотных питательных средах бактерии формируют колонии. Колонии разных бактерий различаются размерами, формой, окраской и прозрачностью. На жидких питательных средах формируется пленка, помутнение или осадок. Культура – микроорганизмы, выросшие на питательной среде.Колония – скопление микробных клеток.

Чистая культура – культура, содержащая микробы одного вида.

Клон – генетически однородная популяция микроорганизмов, выделенная из одной микробной клетки при еѐ прямой изоляции.

Штамм – чистая культура микробов, выделенная из определенного источника в определенное время.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные — путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу (двуспиральная цепь ДНК раскрывается и каждая нить достраивается комплементарной нитью), приводящая к удвоению молекул ДНК бактериального ядра — нуклеоида.

Репликация ДНК происходит в три этапа: инициация, элонгация, или рост цепи, и терминация.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий.

Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура — непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий,

выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов:

Фазы роста популяции бактерий

1 фаза – лаг-фаза (покоя, адаптации)– в этот период микроб вносим в питательную среду, он к ней адаптируется, растет, но не размножается (длится 4-5 часов); Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов.

2 фаза – фаза логарифмического роста – бактерия размножается в логометрической прогрессии (7-8 часов); Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

3 фаза – фаза стационарного роста и покоя – количество делящихся клеток равно количеству погибших (10-12 часов); при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования

4 фаза – фаза отмирания культуры, характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжительность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интенсивность роста и размножения бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

7.Питание бактерий. Типы и механизмы питания бактерий. Аутотрофы и гетеротрофы. Факторы роста. Прототрофы и ауксотрофы.

Органов питания нет. Питательные вещества поступают через всю поверхность клетки. Для питания нужны: кислород, азот, углерод, водород. Кислород и водород микробы берут из воздуха и воды. По источникам азота и углерода микробы делятся на:

-аутотрофы,

-гетеротрофы.

Аутотрофы – (литотрофы) – ―auto‖ - своя, сам, ―trophika‖– питание (―самопитающиеся‖). Это микробы, которые усваивают азот и углерод из воздуха или неорганических веществ. Они имеют много ферментов, поэтому способны сами синтезировать органические вещества из неорганических, для этого они используют солнечную энергию - фотосинтетики и химические вещества – хемосинтетики. Это сапрофитные микроорганизмы.

Гетеротрофы – ―getero‖ – другой, ―trophika‖– питание. Это микробы, которые азот и углерод берут из органических веществ. Они делятся на 2 группы:

–используют органические соединения мертвого субстрата (сапрофиты);

–используют органические соединения организма-хозяина (паразиты). Характеристика конструктивного метаболизма

По способу углеродного питания:

I.Аутотрофы – синтезируют питательные вещества из углекислого газа, воды и неорганических соединений (нет патогенных).

II.Гетеротрофы получают готовые органические соединения. Степень гетеротрофности

определяет степень паразитизма.

1.Сапрофиты питаются мертвыми органическими соединениями либо продуктами жизнедеятельности. Сапрофиты – прототрофы – они сами синтезируют питательные вещества из глюкозы и солей аммония. Чем меньше питательных веществ поступает в бактерию, тем выше уровень биосинтетической активности.

2.Паразиты питаются живыми веществами. По степени гетеротрофности паразиты подразделяются:

a.Условно-патогенные – кишечная палочка, протей, псевдомонады. При нормальном сохранном иммунитете данные микроорганизмы безвредны для человека, они неприхотливы к температуре, рН-среде, у них функционируют все 6 классов ферментов. При ослаблении иммунной защиты данные микроорганизмы переключают метаболизм на паразитизм.

b.Истинные паразиты – сальмонеллы, шигеллы. Прихотливы к температуре (37°), прихотливы к рН-среде. У этих двух представителей утрачиваются

ферменты такие как лиазы и изомеразы, но увеличивается синтез гидролаз, которые расщепляют питательные вещества макроорганизмов. Паразиты – ауксотрофы – то есть нуждаются в двух трех готовых ростовых факторах. Без добавления в питательную среду этого вещества ауксотрофы не растут. (Гемолитический стрептококк)

c.Облигатные внутриклеточные паразиты – хламидии, риккетсии – паразиты на энергетическом уровне (не могут синтезировать цитохромы, поэтому не способны синтезировать АТФ, высшая степень паразитизма – живут внутри клетки).

Взависимости от окисляемого субстрата, называемого донором электронов или водорода, микроорганизмы делят на две группы. Микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода неорганические соединения, называют литотрофны-ми (от греч. lithos — камень), а микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода органические соединения, —

органотрофами

По способу азотного питания:

I.Аминоаутотрофы - питаются неорганическими соединениями;

II.Аминогетеротрофы – используют органические соединения – белки, пурины и пиримидины.

Гниение – процесс глубоко расщепления белка. Характер гниения зависит от:

Вид белка;

Вид микроорганизма;

Условия процесса.

!В результате расщепления белка выделяются:

Вода;

Углекислый газ;

Сероводород;

Индол;

Соли фосфорной кислоты.

Кислород и водород бактерии получают из воды. Бактерии нуждаются в сере, фосфоре, ионах металлов: К, Са, Na, Mg, Zn, Cu, Mn и другие.

Механизмы питания

Все питательные вещества поступают через ЦПМ.

Пассивная диффузия;Облегченная диффузия;Активный транспорт;

Трансмембранная система. Наиболее простой механизм поступления веществ в клетку —

простая диффузия, при которой перемещение веществ происходит вследствие разницы их

концентрации по обе стороны цитоплазматической мембраны. Вещества проходят через липидную часть цитоплазматической мембраны (органические молекулы, лекарственные препараты) и

реже по заполненным водой каналам в цитоплазматической мембране. Пассивная диффузия осуществляется без затраты энергии.

Облегченная диффузия происходит также в результате разницы концентрации веществ по обе стороны цитоплазматической мембраны. Однако этот процесс осуществляется с помощью молекул-переносчиков, локализующихся в цитоплазматической мембране и обладающих специфичностью. Каждый переносчик транспортирует через мембрану соответствующее вещество или передает другому компоненту цитоплазматической мембраны — собственно переносчику. Белками-переносчиками могут быть пермеазы, место синтеза которых — цитоплазматическая мембрана. Облегченная диффузия протекает без затраты энергии, вещества перемещаются от более высокой концентрации к более низкой.

Активный транспорт происходит с помощью пермеаз и направлен на перенос веществ от меньшей концентрации в сторону большей, т.е. как бы против течения, поэтому данный про цесс сопровождается затратой метаболической энергии (АТФ), образующейся в результате окислительно-восстановительных реакций в клетке.

Перенос (транслокация) групп сходен с активным транспортом, отличаясь тем, что переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, например фосфорилируется. Выход веществ из клетки осуществляется за счет диффузии и при участии транспортных систем.

Факторы роста бактерий: витамины, АК, пуриновые и пиримидиновые основания, липиды.

8. Питательные среды. Искусственные питательные среды: простые, сложные, общего назначения, элективные, дифференциально-диагностические.

Питательная среда - среда, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Для культивирования бактерий применяют питательные среды. Они могут быть естественными (молоко, морковь, картофель), искусственными (готовят специально). Питательные среды могут быть жидкие и плотные. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки особого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80—86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застывшем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%).

В зависимости от свойств микробов используют разные среды. Их делят на 4 группы:

1)простые (универсальные) - на них растут только нетребовательные микробы (стафилококки, кишечная палочка). Это МПА И МПБ - мясопептонный агар и бульон.

2)сложные (специальные) - на них растут требовательные микробы (стрептококки, пневмококки). Они готовятся из простых сред путем их обогащения:

-сахарный агар,

-кровяной агар

3)элективные (избирательные) - на них растет только один вид микробов, а другие – нет. Например: 1% щелочная пептонная вода - для холерного вибриона, сахарный агар - для стрептококка, сывороточный агар - для дифтерийной палочки и т.д.

4)дифференциально-диагностические - для отличия одного вида от другого по ферментативной активности (среда Эндо, Гисса).

Требования к питательным средам:

-питательность,

-изотоничность,

-слабощелочная реакция среды (рН 7.2 – 7.4),

-влажность,

-стерильность,

-буферность,

-унифицированность

9. Бактериологический метод изучения микроорганизмов. Принципы и методы!!! выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.

Бактериологический метод диагностики

1 этап: Забор исследуемого материала для диагостики

2 этап: Получение изолированных колоний, в связи с чем проходит посев на питательные среды методом разобщения для накопления чистой культуры

3 этап: Изучение культуральных и морфологических свойств изолированных колоний. (отсев типичных колоний на МПА для накопления чистой культуры)

4 этап Идентификация чистой культуры. Признаки: морфологические, тинкториальные,культуральные, б/х, АГ-е, токсигенные, чувствительность к АБ и БФ

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде.

Колония представляет собой видимое изолированное скопление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей морфологии, цвету и другим признакам.

Культуральные свойства бактерий устанавливаются по морфологии колоний и особенности роста культуры на питательных средах.

Биохимические признаки (свойства) бактерий определяются набором ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту.

Основные принципы выделения и идентификации чистых культур бактерий

Чистую культуру бактерий получают для проведения дифференциально-диагностических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизмов.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по характеру роста на питательной среде.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и питательную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens, золотистый пигмент -Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), синезеленый пигмент - Pseudomas aeruginosa (синегнойная палочка).

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий.

Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру — периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура — непрерывной.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S- и R-формы), различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий. Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают еѐ. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. И, наконец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

10. Способы получения энергии бактериями (брожение, дыхание). Типы дыхания бактерий. Методы культивирования анаэробов.

Энергетический метаболизм

Типы метаболизма:

1.Хемолитотрофы – хемоисточник энергии окислительно-восстановительные реакции; литоисточник электронов неорганические вещества;

2.Хемоорганотрофы – хемо- окислительно-восстановительные реакции; органоорганические вещества;

3.Фотолитотрофы – фотоисточник энергии – солнечный свет;

4.Фотоорганотрофы – фотосолнечный свет; органо – органические вещества.

Способы получения энергии:

Брожение;

Дыхание;

Фотосинтез.

Брожение

Это примитивный энергетический процесс расщепления глюкозы до пировиноградной кислоты. Признаки брожения:

Низкий энергетический выход (2 АТФ на 1 молекулу глюкозы);

Субстратный тип фосфорилирования – реакции протекают в цитоплазме;

Реакции протекают внутримолекулярно;

Акцептором являются органические вещества.

Взависимости от конечного продукта выделяют:

1.Молочнокислое брожение – лактобактерии, бифидумбактерии, стрептококки.

2.Маслянокислое брожение – спорообразующие бактерии;

3.Пропионовокислое брожение;

4.Спиртовое брожение.

Дыхание

Процессы окисления глюкозы до углекислого газа и воды. Дыхание – совершенный энергетический процесс. Признаки дыхания:

Высокий энергетический выход (38 АТФ на 1 молекулу глюкозы);

Мембранный тип фосфорилирования – реакции протекают в мезосомах;

Реакции протекают межмолекулярно;

Акцептор – кислород или неорганические вещества.

Процесс дыхания включает три этапа:

Гликолиз – в цитоплазме клетки образуется ПВК и высвобождается 2 молекулы АТФ;

Цикл трикарбоновых кислот (Кребса) – в мезосомахПВК окисляется до углекислого газа и воды, высвобождается 36 молекул АТФ;

Дыхательная цепь – на цитоплазматической мембране – электроны переносятся на акцептор.

Типы дыхания бактерий:

Строгие аэробы. Функционируют и живут только в присутствии кислорода.

Микроаэрофилы. Нуждаются в кислороде в меньшей степени.

Факультативные анаэробы. Живут в присутствии кислорода и без него. Могут дышать свободным кислородом или кислородными носителями: нитраты, сульфаты, карбонаты;

Облигатные анаэробы. Бактерии, которые только бродят. Для них кислород ядовит. В бактериальной клетке в присутствии кислорода образуется перекись водорода. Облигатные анаэробы не имеют фермента каталазы, расщепляющей перекись.

Методы создания анаэробных условий

1)Физические методы. Методы основаны на выращивании микроорганизмов в среде без воздуха

•Посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества:

В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см. В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьино-кислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующим веществами является среда тиогликолевая которая используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выращенной чистой культуры анаэробов.

• Посев микроорганизмов в глубину плотных питательных сред. Посев уколом