MU13
.pdfГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
Методические указания №13 к практическим занятиям для студентов
ООП специальности 060105.65 Медико-профилактическое дело Дисциплина С2.Б.9 Микробиология, вирусология, иммунология
1.Тема: Иммунитет. Взаимодействие антигена с антителом in vitro.
Серологические реакции, их механизм. Прямые серологические реакции. Реакции агглютинации, преципитации.
2.Цели занятия: Изучить со студентами механизм взаимодействия антигена с антителом in vitro, подразделение серологических реакций на прямые и непрямые, методы постановки реакций агглютинации и преципитации.
3.Задачи занятия:
3.1.Изучение структуры антигенов и антител.
3.2.Изучение механизмов взаимодействия антигенов и антител in vitro.
3.3.Изучение методики постановки реакции агглютинации.
3.4.Изучение методики постановки реакции преципитации.
Шифр |
Содержание |
знать |
уметь |
владеть |
|
компетенции |
|
|
|
ПК-16 |
способность и |
- структуру |
- оценивать |
- методикой |
|
готовность к |
антигенов и |
результаты |
постановки реакции |
|
формулировке, |
антител; |
реакций |
агглютинации на |
|
оценке и проверке |
- прямые |
агглютинации и |
стекле |
|
гипотез, |
серологические |
преципитации |
|
|
объясняющих |
реакции и механизм |
|
|
|
причину, условия и |
их развития; |
|
|
|
механизм |
|
|
|
|
возникновения |
|
|
|
|
заболеваний, их |
|
|
|
|
распространения |
|
|
|
4.Продолжительность занятия в академических часах: 3 часа.
5.Контрольные вопросы по теме:
1.Современное определение понятия “иммунитет”. Виды (формы) иммунитета.
2.Антигены, гаптены, их свойства.
3.Антигенная структура бактериальной клетки.
4.Взаимодействие антигена с антителом in vitro. Прямые и непрямые серологические реакции.
5.Реакция агглютинации, ее механизм и практическое применение.
6.Реакция преципитации, ее механизм и использование.
2
6. Задания и методические указания к их выполнению.
На занятии студенту необходимо выполнить:
6.1.Ответить на вопросы преподавателя.
6.2.Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.
6.3.Поставить реакции агглютинации и кольцепреципитации.
Теоретическая справка Антигены
Антигенами называются вещества, несущие признаки генетически чужеродной информации и при введении в организм вызывающие развитие специфических иммунологических реакций. Природными антигенами являются белки, полисахариды, мукополисахариды, липополисахариды, высокомолекулярные препараты нуклеиновых кислот.
Среди бактериальных антигенов различают структурные антигены, непосредственно связанные с клеткой, и антигены, секретируемые во внешнюю среду. В соответствии с принадлежностью антигенов к определенным структурам бактериальной клетки различают следующие их виды:
Соматический антиген – О-антиген - антиген клеточной стенки бактерий. У грамположительных бактерий основным соматическим антигеном являются тейхоевые кислоты, у грамотрицательных бактерий - это липополисахарид (эндотоксин). О-антиген термостабилен.
Жгутиковый антиген – Н-антиген. Имеется только у подвижных бактерий, состоит из белка флагеллина, термолабилен.
Капсульный антиген - К-антиген. Поверхностный антиген капсулы. Имеет мукополисахаридную или белковую природу, термолабилен. Разновидностью капсульного антигена является Vi-антиген (антиген вирулентности), который имеется, например, у возбудителя брюшного тифа.
Корпускулярными антигенами называются антигены, связанные с бактериальной клеткой, либо с другими нерастворимыми частицами, например, эритроцитами.
Выделяют также растворимые антигены, например, сывороточный альбумин. К секретируемым (растворимым) бактериальным антигенам относятся
экзотоксины и экзоферменты, в том числе, ферменты агрессии.
Антитела
Антителами называются белковые молекулы, способные к специфическому связыванию с антигенными детерминантами. Антитела относятся к гаммаглобулинам. Другое название антител – иммуноглобулины. У млекопитающих существует 5 классов иммуноглобулинов, различающихся по своему строению и некоторым свойствам: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.
Строение иммуноглобулинов.
Наиболее “типичное” строение имеют IgG. Молекула состоит из 4 белковых цепей: двух легких (L) и двух тяжелых (H), которые соединены между собой дисульфидными связями. Центр связывания с антигенной детерминантой называется активным центром антитела. Он образован N-концевыми участками тяжелой и легкой цепей. Участок тяжелых цепей, расположенный вблизи дисульфидных связей, называется шарнирной областью. С помощью фермента
3
папаина молекула IgG выше шарнирной области расщепляется на 3 фрагмента: 2 из них содержали легкую цепь и часть тяжелой цепи, а также активный центр антитела (Fab-фрагменты); третий фрагмент состоял только из остатков тяжелых цепей (Fc-фрагмент). Таким образом, было показано, что молекула IgG имеет два активных центра, то есть является двухвалентной (может связывать 2 молекулы антигена). Благодаря подвижной шарнирной области Fab-фрагменты могут изменять взаимное расположение в пространстве.
Аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей делятся на константный (постоянный) и вариабельный участки. Вариабельные участки находятся на N-концах легких и тяжелых цепей (VL и VH). Константные участки последовательности находятся на С-концах цепей (СL и СH). В легких и тяжелых цепях аминокислотные последовательности образуют несколько глобулярных структур, которые называются доменами.
Активный центр антитела образуется вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей и представляет собой полость (паратоп), имеющую определенную конфигурацию и распределение электрических зарядов на своей поверхности. Размер, форма и распределение зарядов в активном центре определяет его специфичность, т.е. способность связываться с определенной антигенной детерминантой (эпитопом), имеющей комплементарную структуру. Антигенные детерминанты представляют собой участки, выступающие на поверхности молекул антигенов. Поэтому взаимодействие эпитоп-паратоп происходит по принципу “ключ-замок”. Прочность связи активного центра антител с антигенной детерминантой характеризуется понятием аффинность. Аффинность – это мера сродства активного центра и антигенной детерминанты.
На долю иммуноглобулинов класса IgG приходится 75% от общего количества сывороточных иммуноглобулинов. Важным свойством IgG является их способность проходить через плаценту. Таким образом, материнские антитела попадают в организм ребенка и защищают его в первые месяцы жизни от инфекции (естественный пассивный иммунитет).
К классу IgM относится около 10% общего пула иммуноглобулинов. Молекула IgM представляет собой пентамер, т.е. состоит из 5 одинаковых молекул, сходных по своему строению с молекулой IgG, имеет 10 активных центров. Субъединицы соединены между собой дисульфидными связями. В молекуле IgM имеется дополнительная J-цепь, которая связывает субъединицы. Антитела класса IgM не проходят через плацентарный барьер.
Антитела класса IgА составляют 15-20% от общего содержания иммуноглобулинов. Молекула IgА состоит из 2-х легких и 2-х тяжелых цепей, имеет 2 активных центра. В сыворотке крови IgА присутствуют в мономерной форме, тогда как в секретах слизистых оболочек IgА представлены в виде димеров и называются секреторными или sIgА, имеют 4 активных центра. С-концы тяжелых цепей в молекуле sIgА соединены между собой J-цепью и белковой молекулой, которая называется секреторный компонент. Секреторный компонент защищает sIgА от расщепления и инактивации протеолитическими ферментами, которые содержатся в большом количестве в секрете слизистых оболочек. Основная функция sIgА – защита слизистых оболочек от инфекции. IgА не проникают через плацентарный барьер. Высокая концентрация sIgА обнаруживается в женском
4
грудном молоке, особенно в первые дни лактации. Они защищают желудочнокишечный тракт новорожденного от инфекции.
IgD – в основном находятся на мембране В-лимфоцитов. Имеют строение, подобное IgG, 2 активных центра. Биологическая роль до конца не известна.
IgЕ – концентрация этого класса иммуноглобулинов в сыворотке крови чрезвычайно низкая. Молекулы IgЕ в основном фиксированы на поверхности тучных клеток и базофилов. По своему строению IgЕ сходен с IgG, имеет 2 активных центра. Предполагается, что IgЕ имеет существенное значение в развитии антигельминтозного иммунитета. IgЕ играет главную роль в патогенезе некоторых аллергических заболеваний (бронхиальная астма, сенная лихорадка) и анафилактического шока.
Серологические реакции
Реакции антиген-антитело, происходящие in vivo – это важнейший защитный механизм устранения чужеродных антигенов из организма путем образования иммунных комплексов. Серологическими реакциями называются реакции антиген-антитело, происходящие in vitro (в пробирке). Они используются для количественного и качественного определения антигенов и антител в исследуемом материале.
При постановке серологических реакций учитывают следующие условия: наличие изотонического раствора (электролита), реакция рН (близкая к нейтральной) и температура среды (от 20 до 37°С).
Серологические реакции применяются с целью решения следующих задач:
-для выявления неизвестного антигена (микроорганизма, белка и т.д.); при этом используют диагностические иммунные антисыворотки, которые получают путем многократной иммунизации лабораторных животных соответствующими антигенами;
-для определения наличия и титра антител в сыворотке крови; обнаружение антител проводят с использованием специальных антигенных диагностикумов (взвеси эталонных инактивированных микроорганизмов).
Таким образом, в серологических реакциях один из двух основных компонентов (антигены или антитела) всегда должен быть известным.
Серологические реакции подразделяются на прямые и непрямые.
В прямых серологических реакциях результат взаимодействия антигенов с антителами наблюдается непосредственно по изменению оптических свойств раствора (образование хлопьев, помутнение, опалесценция). К прямым серологическим реакциям относятся реакции агглютинации, преципитации и флоккуляции.
В непрямых серологических реакциях для визуализации результата взаимодействия антигенов и антител используются индикаторные системы (эритроциты, комплемент, лабораторные животные). К непрямым серологическим реакциям относятся реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации, реакция нейтрализации токсина антитоксической сывороткой, и др.
Реакция агглютинации (РА)
Агглютинацией называется склеивание бактерий в результате взаимодействия
сними специфических антител. Для проведения РА необходимы три компонента:
5
1)антиген (агглютиноген);
2)антитело (агглютинин);
3)раствор электролита (изотонический раствор хлорида натрия).
В реакции агглютинации принимают участие только корпускулярные антигены (бактерии, эритроциты, нагруженные антигеном частицы латекса).
Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки (разведение сыворотки 1:10 - 1:20). Бактериологической петлей берут чистую культуру исследуемого микроорганизма с поверхности скошенного агара, переносят в каплю сыворотки и перемешивают. Результат реакции учитывают невооруженным глазом через 3-5 минут. При положительной реакции в капле сыворотки отмечают появление хлопьев (крупных или мелких), хорошо видимых на темном фоне при покачивании предметного стекла. В случае отрицательной реакции жидкость остается равномерно мутной.
Реакция агглютинации в пробирках. В ряд пробирок вносят по 1 мл физиологического раствора. В первую пробирку прибавляют равный объем исследуемой сыворотки крови. Готовят последовательные двукратные разведения сыворотки (титрование сыворотки), после чего в каждую пробирку вносят по 2 капли взвеси инактивированных бактерий (диагностикум). Пробирки помещают на 2 часа в термостат при 37°С. Реакция протекает с образованием мелких хлопьев, невидимых невооруженным глазом, поэтому учет результатов проводят под небольшим увеличением в специальном приборе – агглютиноскопе. Интенсивность агглютинации учитывают по системе “четыре плюса”: полная агглютинация - 4+, частичная агглютинация - 3+ или 2+, сомнительный результат - +. За титр антител в исследуемой сыворотке принимают последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация на 2+.
Реакцию агглютинации в пробирках (развернутая реакция агглютинации) проводят для определения титра антител к возбудителям брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), бруцеллеза (реакции Райта), сыпного тифа
(реакция Вейгля).
Реакция преципитации (РП)
Реакцией преципитации называется осаждение из раствора АГ (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) в растворе электролита. Осадок представляет собой макромолекулярный иммунный комплекс (преципитат). Выпадение нерастворимого комплекса антиген-антитело в виде осадка наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингредиентов – в зоне эквивалентности. Зоной эквивалентности называется область, в которой все антитела количественно связаны с антигеном. В реакции преципитации принимают участие только растворимые антигены (экстракты из микроорганизмов, органов и тканей, продукты распада клеток микроорганизмов).
Преципитирующие сыворотки изготавливают путем гипериммунизации животных (кроликов).
Реакция кольцепреципитации. В пробирку наливают 1,0 мл неразведенной преципитирующей сыворотки. Пипеткой медленно наслаивают по стенке пробирки (пробирку держат в наклонном положении) антиген в таком же объеме. Затем пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При
6
правильном наслоении антигена на сыворотку четко видна граница между двумя слоями жидкости. Результаты реакции учитывают через 1-2 минуты. В случае положительной реакции в опытной пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде белого кольца.
С помощью РП можно выявить не только видовую, но и групповую специфичность белка. Например, определить степень родства различных видов животных и растений. В судебной медицине РП используется для определения видовой принадлежности белка (сыворотки крови). Применение РП для санитарногигиенического контроля пищевых продуктов позволяет выявить фальсификацию мясных, рыбных, мучных изделий, примеси в молоке и т.д.
Недостатками РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании, а также невозможность установить количество разных антигенов, участвующих в формировании преципитата.
Этих недостатков лишены реакции преципитации в геле. К ним относятся реакция иммунодиффузии по Оухтерлони, и реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини.
Реакция встречной иммунодиффузии по Оухтерлони. Метод иммунодиффузии основан на встречной диффузии антигена и антител в агаровом геле. Для постановки реакции расплавленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку, после затвердевания в нем вырезают лунки диаметром 2-3 мм, которые заполняют антигеном или сывороткой. Антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу и в месте контакта в эквивалентных соотношениях образуют линии преципитации в виде белой полосы.
Реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини. При постановке реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини в расплавленный агар вносят иммунную сыворотку. После застывания геля в нем делают лунки, в которые помещают антиген. Антиген, диффундируя в гель, взаимодействует с антителами, присутствующими в агаре. В результате образуется радиальная зона преципитации, диаметр которой пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для количественного определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов.
Реакция флоккуляции
Реакцией флоккуляции называется появление опалесценции или хлопьевидной массы при добавлении в пробирку с токсином (анатоксином) антитоксической сыворотки. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.
После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.
Самостоятельная работа:
1.Поставить реакцию агглютинации на стекле с дизентерийными сыворотками и культурой неизвестного микроорганизма.
2.Поставить развернутую реакцию агглютинации с сывороткой крови больного брюшным тифом и брюшнотифозным диагностикумом (реакция Видаля).
Сэтой целью в пробирках готовят двукратные разведения сыворотки крови больного брюшным тифом от 1:100 до 1:1600 в объеме 1 мл на физиологическом
7
растворе. После этого во все пробирки, включая контрольную (содержит 1 мл физиологического раствора), прибавляют по 2 капли брюшнотифозного диагностикума. Пробирки помещают в термостат при 37ОС на 24 часа. Результаты реакции учитывают с помощью агглютиноскопа.
3. Поставить реакцию кольцепреципитации с целью определения видовой принадлежности сыворотки крови. Для этого в 2 пробирки вносят по 1 мл сыворотки, преципитирующей человеческий белок, затем осторожно по стенке пробирки наслаивают равный объем антигена (сыворотку барана – контроль и сыворотку человека – опыт). При положительной реакции появляется кольцо преципитации. Положительная реакция указывает на видовую принадлежность сыворотки крови.
7. Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:
Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.
8. Литература для подготовки темы:
8.1.Основная:
1.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.
2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 1 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 448 с.: ил.
3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. В 2-х т. Том 2 : учеб. по дисциплине “Микробиология, вирусология и иммунология” для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальностям 060101.65 “Лечеб. дело”, 060103.65 “Педиатрия”, 060104.65 “Медико-профилакт. дело” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 480 с.: ил.
8.2.Дополнительная:
1.Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и
доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.
2.Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.
3.Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.
Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.
Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.