- •Інструкція з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції
- •Динаміка бактеріологічного дослідження хворого
- •1 Збір патологічного матеріалу для виявлення мікобактерій туберкульозу
- •1.1 Харкотиння
- •1.2 Промивні води бронхів
- •1.3 Промивні води шлунка
- •2.2 Бактеріоскопічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.2.1 Пряма бактеріоскопія мазка з фарбуванням за Цілем - Нільсеном
- •Реактиви
- •Спеціальне обладнання
- •2.2.2 Метод збагачення
- •2.2.3 Люмінесцентна мікроскопія
- •2.2.4 Фазовоконтрастна мікроскопія
- •2.3 Бактеріологічні методи виявлення мікобактерій туберкульозу
- •2.3.1 Обробка патологічного матеріалу при посіві на щільне живильне середовище
- •Обробка трьохзаміщеним фосфорнокислым натрієм
- •Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
- •4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
- •Обробка кислотою
- •2.3.2 Живильні середовища
- •2.3.2.1 Приготування щільних живильних середовищ
- •2.3.2.2. Рідкі живильні середовища
- •Напівсинтетичне середовище Школьнікової.
- •2.4 Біологічний метод дослідження
- •3 Ідентифікація виділених культур мiкобактерiй
- •3.1 Бактеріологічний (культуральний) метод дослідження
- •Атипові мікобактерії
- •3.2 Диференціація мікобактерій
- •3.2.1 Культуральні тести
- •3.2.1.1 Приготування середовища із саліциловокислим натрієм
- •3.2.1.2 Приготування середововища з паранітробензойною кислотою
- •3.2.1.3 Приготування середовища з тіоацетазоном (тібоном)
- •3.2.1.4 Ріст на середовищі з 5 % NаСl
- •3.2.1.5 Виявлення корд-фактора
- •3.2.2 Бiохiмiчнi методи дослідження
- •3.2.2.1 Ніациновий тест
- •3.2.2.2 Визначення амiдазної активності
- •Метод Бьоніке
- •Визначення нікотинамiдазної активності
- •Метод Таке
- •Визначення формамiдазної активності
- •3.2.2.3 Визначення нiтратредуктазної активності
- •3.2.2.4 Диференціація мiкобактерiй за окисно-відновними ферментами
- •Визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно
- •Термостабiльнiсть каталази
- •Визначення активності термостабільної каталази
- •3.2.2.5 Реакція гiдролiзу твiну-80
- •3.2.2.6 Ключові тести і схеми ідентифікації мікобактерій
- •3.3 Біологічний метод ідентифікації кислотостійких мiкобактерiй
- •4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій
- •4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit
- •4.2 Визначення медикаментозної стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин, етамбутол) за допомогою системи bbl mgit ast sire
- •4.3 Виявлення мікобактерій за допомогою середовища вкг (стимулятор росту і середовище вкг) (в.В.Власенко)
- •4.3.1 Постановка досліду по контролю якості живильного середовища вкг
- •1 Етап – відбір і попередня обробка досліджуваного матеріалу для характеристики днк
- •Відбір та підготовка клінічного матеріалу для аналізу.
- •Форма випуску та пакування.
- •Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.
- •3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу
- •Порядок проведення робіт.
- •Форма випуску й пакування.
- •5 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1 Критерії стійкості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів
- •5.1.1 Визначення чутливості мiкобактерiй туберкульозу до антимікобактеріальних препаратів методом абсолютних концентрацій на щільних середовищах
- •5.1.1.1 Розведення антимікобактеріальних препаратів
- •Iзонiазид
- •5.1.2 Визначення стійкості мбт до антимікобактеріальних препаратів
- •I Приготування розведень антимікобактеріальних препаратів
- •II Приготування суспензії культури мбт
- •5.3 Визначення чутливості мікобактерій туберкульозу до декількох антимікобактеріальних препаратів
- •5.4 Визначення чутливості m.Tuberculosis до антимікобактеріальних препаратів з використанням кров’яного живильного середовища
- •5.5 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих
- •5.5.1 Визначення концентрації антимікобактеріальних препаратів у крові хворих методом серійних розведень в рідкому середовищі
- •5.5.1.1 Схеми розведення антимікобактеріальних препаратів для визначення мік
- •Iзонiазид
- •Рифампіцин (рифадин, мікобутин)
- •Етамбутол
- •Канаміцин
- •Фторхінолони (ципробай або інший ципрофлоксацин чи офлоксацин)
- •5.5.1.2 Визначення бактеріостатичної активності крові (бак) після прийому хворим антимікобактеріальних препаратів (туберкулостатична проба)
Обробка лугом з використанням гідроокису натрія - модифікований метод Петрова (використовується за рекомендаціями вооз)
Реагенти:
4,0 % Гідроокис натрію (NaОн):
Гідроокис натрію (хімічно чистий) - 4,0 г.
Дистильована вода - 100,0 мл.
Розчинити NaОН в дистильованій воді й стерилізувати автоклавуванням при 121 0 С протягом 15 хв.
Стерильний розчин NaОН можна зберігати протягом декількох тижнів. Зберігати в пластиковому посуді.
Стерильний ізотонічний розчин хлориду натрію:
Хлорид натрію (хімічно чистий) - 0,85 г.
Дистильована вода - 100,0 мл.
Розчинити NaCl в дистильованій воді і стерилізувати автоклавуванням при 121 0С протягом 15 хв.
Методика.
До харкотиння додати подвійний об’єм 4,0 % розчину NaОН.
Закрити флакон кришкою і струсити.
Залишити на 15 хв. при кімнатній температурі та періодично струшувати.
Центрифугувати при 3500 об/хв. протягом 15 хвилин.
Видалити надосадну рідину.
Додати 15,0 мл стерильного ізотонічного розчину NаCl або дистильованої води та ресуспендувати осад.
Центрифугувати при 3500 об/хв. протягом 15 хвилин.
Видалити надосадну рідину і негайно провести засів на живильне середовище.
Метод з використанням NaOH простий і дешевий; при цьому досягається добра очистка від контамінантів.
Гідроокис натрію є токсичним по відношенню як до контамінантних мікроорганізмів, так і до туберкульозних бактерій. Тому при використанні даного методу необхідно чітко додержуватися вказаної тривалості кожного етапу обробки.
Обробка досліджуваних проб методом NALC-OH - N-ацетил-L-цистеїном з гідроксидом натрію
Більш щадящим методом обробки матеріалу є метод з використанням N-ацетил-L-цистеїну і гідроокису натрія (NALC-OH).
Застосування муколітичного препарату NALC (який використовується для швидкого розрідження харкотиння) дозволяє знизити концентрацію деконтамінуючого субстрату (NaOH) до 1,0 %. Цитрат натрію, який включений до літичної суміші, є необхідним для зв’язування йонів важких металів, які можуть бути присутніми в пробі та інактивовувати дію ацетилцистеїну.
Обробка досліджуваних проб методом NALC-OH переслідує 3 мети:
- деконтамінація;
- гомогенізація;
- збагачення.
Даний метод обробки проб є найбільш щадящим. Час експозиції після внесення NALC-OH 20 хвилин і температурний режим (20 0С) дозволяє зберегти життєздатність 85,0 % клітин мікобактеріальної популяції, що знаходиться в досліджуваному матеріалі.
Приготування розчинів.
Розчин 1: |
- 40,0 г NaOH розчинити в 1000,0 мл дистильованої води. |
Розчин 2: |
- 32,5 г Na-цитрату розчинити в 1000,0 мл дистильованої води. |
Розчини 1 і 2 автоклавують 20 хвилин при 121 0С.
|
- 50,0 мл розчину 1; |
Розчин 3: |
- 50,0 мл розчину 2; |
|
- 0,5 г N-ацетил-L-цистеїну. |
Розчин 3 готувати кожен день!!!
Фосфатний буфер - рН 6,8: |
- 11,64 г Na2HPO4 х 2Н2О; |
|
- 9,26 г KH2PO4 |
Розчинити в 2000,0 мл дистильованої води, встановити рН, автоклавувати при 121 0С 20 хвилин |
|
Хід дослідження
- 10,0 мл досліджуваної проби змішати з розчином 3 в рівних кількостях;
- змішувати, струшуючи протягом 20 хвилин при кімнатній температурі;
- додати фосфатний буфер до 50,0 мл, перемішати;
- центрифугувати при 3500 об/ хв 20 хвилин;
- надосад злити;
- до осаду додати 1,0 мл фосфатного буфера, струсити, негайно посіяти.
Особливості обробки сечі методом NALC-OH
Для дослідження використовують ранкову порцію сечі в кількості 50,0 мл.
-
Готують суміш:
- 50,0 мл сечі;
- 0,5 мл плазми;
- 3 краплі 20,0 % сульфосаліцилової кислоти;
- 1 краплю 1,0 % твіну 80.
Обережно перемішують.
Для осадження білку залишають на 2 години в холодильнику (при + 4 0С). Потім пробу центрифугують при 3500 об/хв 20 хвилин і зливають надосадну рідину.
Осад обробляють за методом NALC-OH.
Обробка досліджуваних проб харкотиння методом Necal - BX (модифікований)
(Necal-BX - диизобутилнафталансульфонат)
Приготування розчинів.
|
- 0,1 г Necal-BX (сухий порошок); |
Розчин 1: |
- 5,0 г твердого кристалічного NaOH; |
|
- розчинити в стерильній дистильованій воді, довести об’єм суміші до 1000 мл. |
|
- 2,0 г СаCl2 x 2H2O (СаCl2 без води - 1,5 г); |
Розчин 2: |
- 4,0 г BaCl2 x H2O; |
|
- розчинити в стерильній дистильованій воді, довести об’єм суміші до 100 мл. |
Розчини 1 і 2 не потребують автоклавування. Зберігають стабільність при 4-25 0С протягом 4 тижнів.
Хід дослідження
1 частину (приблизно 2,0 мл) досліджуваного матеріалу (наприклад, харкотиння) ретельно змішують з 5 частинами (приблизно 10,0 мл) розчину 1 і 2 краплями розчину 2. Інкубують до 20 годин при кімнатній температурі. Після цього негайно центрифугують при 3500 об/хв, зливають надосадну рідину, осад засівають на живильне середовище Льовенштайна-Єнсена.