Комплектність набору для ампліфікації днк m.Tuberculosis,м.Bovis наведена в табл.4.4.

Таблиця 4.4 - Комплектність набору для ампліфікації ДНК M.tuberculosis, М.bovis

№	Найменування компонентів в упаковці (напис на етикетці)	Номінальний об’єм (см3)	Вид пакування	К-сть штук
1	ПЛР – буфер	1	Пластикова пробірка ємністю 2 см3	2
2	Пробірки Майстер-Мікс (маркерування кольором)	Суха суміш	Блакитна пластикова пробірка ємністю 0,5 см3	100
3	Масло мінеральне (Мін. масло)	2	Пластикова пробірка ємністю 2 см3	2
4	Вода дейонізована (дд-вода)	2	Пластикова пробірка ємністю 5 см3	1
5	Позитивний контроль (К+)	Суха суміш	Червона пластикова пробірка ємністю 0,5 см3	5
6	Негативний контроль (К–)	Суха суміш	Безбарвна пластикова пробірка ємністю 0,5 см3	5

3 Этап – детекція продуктів ампліфікації за допомогою гельелектрофорезу

Здійснюється з використанням комплекту реактивів № 3 із набору MYC– ТЕSТ.

Порядок проведення робіт.

1. Приготування буферного розчину для електорофорезу (БЕ).

Розчинити вміст пакета з написом «Буфер для електрофорезу» в 200 см³ дистильованої води й довести об’єм розчину до 1 л. Після приготування зберігати розчин при температурі плюс 4,0 ⁰С.

2. Приготування гелю агарози.

В конічну термостійку колбу, ємністю 250 см³ внести вміст одного пакета з агарозою, додати 200 см³ БЕ та помістити колбу на електричну плитку. Довести вміст колби до кипіння і через 10 – 20 хвилин, після того як агароза повністю розчиниться, колбу з розплавленою агарозою зняти з плитки. Розчин агарози, що отримали, повинен бути прозорим і не повинен містити окремих нерозплавлених часток.

3. Підготовка електрофоретичної камери до заливання гелю агарози.

Встановити кришку з ванночкою на камеру, а платформу для заливання гелю помістити у ванночку. Встановити гребінчик (можна встановити 2 і навіть 4 гребінчики залежно від кількості проб, що аналізуються) на платформу.

4. В колбу з розчином агарози внести 5,0 мкл етідіума броміду, старанно й обережно перемішати вміст колби рівномірними обертовими рухами. Після цього розплавлену агарозу охолодити до 50 ⁰С при кімнатній температурі.

5. Охолоджену до 50 ⁰С агарозу вилити на платформу. Товщина шару агарози повинна бути не меншою за 4 мм.

6. Після застигання гелю агарози (приблизно через 25 – 30 хвилин) обережно витягнути гребінчик, не пошкодивши при цьому карманів, платформу з агарозним гелем перенести з ванночки в електрофоретичну камеру.

7. Залити 800 см³ розчину БЕ в електрофоретичну камеру так, щоб він вкривав агарозний гель шаром 5 – 6 мм.

8. Додати в пробірку з «Контрольним зразком ДНК» 50,0 мкл бідистильованої води. Перемішати вміст до повного розчинення осаду. Додати в розчин 10,0 мкл фарби-лідера. Внести рекомендовану кількість фарби-лідера в проби, що аналізуються, та перемішати.

Внести в одну лунку з гелем під шар БЕ 5,0 мкл приготованого «Контрольного зразка ДНК» і в інші по 5,0 – 20,0 мкл проб, що аналізуються, з попередньо внесеною фарбою-лідером так, щоб вміст заповненого пробою карману не перетікав у інший.

9. Проведення електрофорезу.

Встановити кришку на камеру, підключити електрофоретичну камеру до джерела живлення, встановити на джерелі живлення напругу в 200 V (не більш 15 V/см). Через 25 – 35 хвилин електрофоретичну камеру відключити від джерела живлення, від’єднати дроти та тільки після цього зняти кришку з електрофоретичної камери. Дістати платформу з гелем з електрофоретичної камери, дати рідині стекти й обережно промити гель дистильованою водою.

Примітка. При роботі з гелем агарози при додаванні етідіуму бромідіу і подальшому дослідженні, слід обов’язково надягати гумові рукавички !

10. Облік результатів.

Після проведення електрофорезу гель агарози виймають з приладу для електрофорезу, продивляються або (і) фотографують на фотоплівку типу “ Мікрат 300 “ або “ Ізопан “ в ультрафіолетовому світлі з довжиною хвилі 254 або 310 нм з використанням флуоскопа. Продукт ампліфікації на фотоплівці видно у вигляді темної смужки. Допускається використання інших методів аналізу електрофореграм (використання цифрових або телекамер, сканування гелю).

Особливістю тест-системи, що пропонується, є наявність у “ПЛР-пробірках“ ДНК внутрішнього стандарту (ВС). ВС дозволяє контролювати проходження реакції у кожній пробірці, яка утримує ДНК досліджуваного зразка, що виключає отримання помилково-негативних результатів аналізу.

Чутливість визначення – 50 геном/екв.

Розмір амплікона мішені – 229 н.п.

Розмір амплікона ВС – 335 н.п.

Можливі варіанти електрофорезу продуктів ампліфікації наведені на рис. 4.1.

1 2 3 4 5 6 7 8

ВС МІШЕНЬ …

…..

…..

…..

…..

….. К+

….. ММ

….. К–

Примітки:

1. 1 – 5 – клінічні зразки;

2. 6 – 7 – позитивний контроль;

3. 8 – негативний контроль;

4.  ВС - смужка в гелі, що відповідає розміру амплікона внутрішнього

стандарту;

5.  МІШЕНЬ - смужка в гелі, що відповідає ділянці ДНК

M. tuberculossis, М. bovis, яка ампліфікується.

Рис. 4.1 - Можливі варіанти електрофорезу продуктів ампліфікації

На рисунку 4.1 в колонці 1 смужки ампліконів відсутні. Це означає, що реакція не пройшла і аналіз необхідно повторити.

В колонці 2 видно тільки смужку ВС. Це означає, що результат негативний (у досліджуваному зразку ДНК M. tuberculosis, М. bovis відсутня або її кількість менша, ніж 50 геном/екв у 5,0 мкл розчину виділюваної ДНК).

В колонці 3 видно тільки смужку амплікона мішені – результат позитивний. ВС пригнічений великою кількістю мішеней.

В колонці 4 видно смужки ампліконів ВС та мішені. Це означає, що реакція позитивна (в 5,0 мкл розчину виділеної ДНК знаходиться 50-1000 геном/екв мікобактерій). Співвідношення інтенсивності смужок може бути різним.

В колонці 5 видно слабке світіння смужок амплікона мішені та ВС. Це свідчить, що, можливо, в реакції присутній інгібітор. Необхідно повторити аналіз.

В колонці 6 - позитивний контроль реакції (К⁺) пройшов нормально і вказує на те, що в пробі присутня невелика кількість мішені.

В колонці 7 - контроль пробірок Майстер-Мікс (ММ). Позитивний контроль реакції пройшов нормально.

В колонці 8 присутня тільки смужка ВС, це означає, що негативний контроль реакції (К^–) пройшов нормально*.

* Примітка. Якщо негативний контроль проходить за варіантами 6 або 7, то необхідно з’ясувати джерело контамінації та повторити аналіз.