4 Прискоренні методи виявлення мікобактерій

4.1 Виявлення мікобактерій за допомогою індикаторної пробірки bbl mgit

Принцип. Пробірка BBL MGIT для виявлення росту мікобактерій містить модифікований бульйон 7Н9 Міддлбрука, доповнений OADC-збагаченням BBL MGIT, який підтримує ріст мікобактерій та забезпечує їх виявлення, і сумішшю антибіотиків BBL MGIT PANTA. Трубка BBL MGIT містить флуоресцентну сполуку, запаяну в силікон на дні круглодонної пробірки розміром 16,0 х 100,0 мм. Ця сполука реагує на присутність кисню, розчиненого в бульйоні. Вихідна концентрація кисню не дає яскравого світіння. У випадку присутності в дослідній пробі мікобактерій та їх розмноження, відбувається активне поглинання О₂ й виділення СО₂, що дає можливість спостерігати яскраву флюоресценцію за допомогою 365-нм УФ-трансосвітлювача або довгохвильового УФ-світла (лампа Вуда).

Реактиви.

Індикаторна пробірка BBL MGIT для виявлення росту M.tuberculosis містить 110,0 мкл флуоресцентного індикатора і 4,0 мл бульйону 7Н9 Міддлбрука. Індикатор містить пентагідрат хлористого трис-4,7-дифеніл-1,10-фенантролінрутенію в силіконовій основі. Пробірки промиті 10,0 % СО₂ і закриті поліетиленовими ковпачками.

Вміст в 1,0 л дистильованої води:

модифікований бульйон 7Н9 Міддлбрука – 5,9 г ;

казеїновий пептон – 1,25 г ;

гліцерин – 3,1 мл.

BBL MGIT OADC призначено для збагачення бульйону Міддлбрука з метою швидкого росту мікобактерій і містить 15,0 мл OADC-збагачення.

Вміст в 1,0 л дистильованої води:

- О – олеїнова кислота – 0,6 г;

- А – альбумін бичачий – 50,0 г;

- D – декстроза – 20,0 г;

- С – каталаза – 0,03 г.

Ампула BBL MGIT PANTA містить ліофілізовану суміш антимікробних агентів для пригнічення росту супутньої мікрофлори.

Вміст в 1 ампулі ліофілізованої PANTA:

поліміксин В – 6000 од.; амфотеріцин В – 600,0 мкг; налидиксова кислота – 2400,0 мкг; триметоприм – 600,0 мкг; азиоцилін – 600,0 мкг.

Перед вживанням додати в ліофілізовану ампулу з сумішшю антибіотиків MGIT PANTA 3,0 мл стерильної дистильованої води. Також необхідно перевірити кожну пробірку MGIT з метою виявлення забруднення або пошкодження. Викинути будь-які пробірки, якщо вони є непридатними або дають флюоресценцію до використання.

Зберігання реактивів. Індикаторні пробірки BBL MGIT для виявлення росту мікобактерій зберігати при 2 – 25 ⁰С, не заморожувати. Бульйон повинен бути прозорим і безбарвним. Не використовувати бульйон, якщо він каламутний. Пробірки MGIT, які зберігаються так, як вказано на етикетці, можна засівати аж до дати закінчення терміну придатності та інкубувати на протязі восьми тижнів.

OADC BBL MGIT необхідно зберігати в темряві при 2 – 8 ⁰С; уникати заморожування або перегрівання. Не відкривати до вживання.

Ампули з ліофілізованою сумішшю антибіотиків зберігати при 2 – 8 ⁰С. Після розведення суміш PANTA можна використовувати на протязі 72 годин (при 2 – 8 ⁰С), або на протязі 6 місяців (при - 20 ⁰С або більш низький температурі). Після розморожування суміш PANTA слід використовувати негайно; невикористану частину викинути.

Індикаторним експрес-методом на наявність M.tuberculosis можна досліджувати всі види клінічних проб (легеневих, або позалегеневих), крім сечі та крові. Обробку проб слід проводити N-ацетил-L-цистеїном з гідроокисом натрію (NALC – NaOH).

Хід дослідження.

1. Безпосередньо перед дослідженням приклеїти на пробірку MGIT етикетку з номером проби, відкрутити ковпачок пробірки MGIT й в асептичних умовах додати 0,5 мл MGIT OADC і 0,1 мл розведеної суміші антибіотиків MGIT PANTA.

2. Додати 0,5 мл концентрованої суспензії попередньо обробленої проби. Об’єм проби більше 0,5 мл може збільшити обсіменіння неспецифічною мікрофлорою. Після внесення матеріалу пробірки щільно закрити ковпачками і добре перемішати. Інкубувати в термостаті при 37 ⁰С.

3. Показання пробірок враховувати щодня, починаючи з другого дня інкубації. Для інтерпретації результатів застосовують пробірки з негативним (К^-) і позитивним (К⁺) контролем.

Як негативний контроль (К^-) використовується закрита незасіяна пробірка MGIT. В К^- повинна спостерігатися дуже незначна флюоресценція або зовсім її не повинно бути.

Підготовка пробірки для К⁺ :

Вилити бульйон Міддлбрука з незасіяної пробірки MGIT, наклеїти на пробірку етикетку з написом “Позитивна-контрольна”, приготувати 0,4 % розчин сульфіту натрію (0,4 г на 100,0 мл стерильної дистильованої води), 5,0 мл цього розчину внести в пробірку MGIT, щільно закрити ковпачком й залишити на 1 годину при кімнатній температурі. Контрольні пробірки К⁺ можна використовувати протягом 4 тижнів, зберігаючи при кімнатній температурі. В К⁺ повинна спостерігатися яскрава флюоресценція (жовтогарячого кольору).

Облік показань пробірок.

1. Витягти пробірки з термостату, помістити їх під УФ-світло поряд з контрольними пробірками К⁺ і К^-. Рекомендується розміщувати під УФ-світлом один штатив з пробірками (4 по 10 пробірок) одночасно.

2. Флюоресценція виявляється як яскраво-жовтогарячий відтінок на дні пробірки і дає жовтогаряче відображення на меніску. Потім витягти цю пробірку MGIT з штативу і зрівняти з контрольними пробірками К⁺ і К^-. Якщо флюоресценція в дослідній пробірці MGIT більше схожа на флюоресценцію в контрольній пробірці К⁺, то ця пробірка з позитивним результатом. Якщо ж флюоресценція більше схожа на флюоресценцію в контрольній пробірці К^-, то ця пробірка з негативним результатом. Ріст можна також виявити по наявності неоднорідної каламутності, дрібних зерен або лусочок в культуральному середовищі.

3. Вміст пробірок з позитивними результатами слід пофарбувати за Цілем-Нільсеном. Наявність в мазку кислотостійких паличок рубінового кольору вказує на передбачувану присутність життєздатних мікобактерій в пробірці.

4. Облік показань пробірок з негативним результатом слід продовжувати щодня на протязі восьми тижнів, оскільки флюоресценція в пробірках MGIT може з’явитися протягом певного часу.

Пробірки з позитивним результатом можуть містити один або декілька видів мікобактерій. Мікобактерії, що швидко ростуть, можуть викликати флюоресценцію раніше мікобактерій, що ростуть повільно. Цей факт необхідно враховувати при ідентифікації мікобактерій.

Морфологію і пігментацію колоній можна визначати лише на щільних середовищах. Матеріал з пробірки MGIT з позитивним мазком кислотостійких паличок можна пересівати як на щільні, так і рідкі, живильні середовища з метою проведення в подальшому ідентифікації і визначення медикаментозної стійкості.